E. Alat dan Bahan Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian berturut-turut disajikan pada Tabel 1:
Tabel 1 Alat penelitian
No Uraian
Alat 1.
Pengambilan sampel organ Alat bedah, pinset, plastik steril
2. Penyimpanan sampel organ
Freezer -20°C 3.
Isolasi DNA Latex glove, pisau silet, pinset, neraca
Ohaus Pioneer
TM
, microtube 1,5 ml, rak microtube, dry bath, microcentrifuge
survall Legend MICRO 17 R, kotak sampel, tip kuning biru, lemari
pendingin Sharp-20°C, inkubator dan vortex Labnet®, mikropipet Eppendorf,
tabung QIAamp Mini Spin.
4. Elektroforesis hasil isolasi dan
amplifikasi DNA Rak microtube, well forming combs,
horizontal elektroforesis Mupid ®-eXu, Gel doc
TM
XR+ with Image Lab
TM
soft ware, Hot plate Cimarec®, tip kuning
putih, mikropipet Eppendorf . 5.
Amplifikasi DNA GeneAmp® PCR System 9700 Applied
Biosystem, microtube 0,2 µl, mikropipet Eppendorf,
tip kuning
putih, microcentrifuge survall Legend MICRO 17
R, vortex.
Tabel 2 Bahan Penelitian
No Uraian
Bahan 1.
Isolasi DNA Tissue Lysis Buffer, Proteinase K, Lysis
Buffer, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, Elution Buffer, Etanol Absolut, Etanol 80,
RNase, Tris-EDTA.
2. Elektroforesis hasil isolasi
dan amplifikasi DNA Ultrapure
TM
Agarose Invitrogen
TM
, EtBr aMResco®, Bufer TBE 0,5X, loading buffer
Invitrogen®, DNA
ladder aMResco®,
parafilm M®, shaker DRS-12 3.
Amplifikasi DNA Primer rPLU1, rPLU5, Primer rPLU3,
rPLU4 Invitrogen®,
dNTPs Applied
Biosystem®, Enzim taq polymerase Applied Biosystem®,
ddH
2
O, MgCl
2
Applied Biosystem®,
,
Buffer A
F. Prosedur Penelitian
a. Perolehan sporozoit dan isolasinya. Sporozoit diperoleh dengan terlebih dahulu melakukan penginfeksian
secara intraperitoneal P. berghei ±1x10
6
parasit inokulum stadium eritrositik pada mencit dan 2 hari kemudian diamati parasitemia dalam darah mencit setiap
hari dengan mengambil darah perifer dari ujung ekor. Setelah diperoleh parasitemia ±10, mencit terinfeksi diletakkan dalam kandang nyamuk
Anopheles sp. dan dibiarkan nyamuk mengigit mencit. Nyamuk yang mengkonsumsi darah terinfeksi dipelihara selama 14-16 hari dalam kandang
khusus untuk memperoleh sporozoit. Nyamuk tersebut diiradiasi sinar gamma dosis 0 dan 175 Gy selama 30 menit. Isolasi kelenjar ludah nyamuk yang
mengandung sporozoit dilakukan dengan membedah nyamuk menurut prosedur standar. Isolat dilarutkan dalam NaCl 0,9. Isolat kelenjar ludah kemudian
disuntikkan secara intravena pada 3 mencit sehat melalui ekornya sebanyak 100µl setiap kali penyuntikan. Untuk beberapa perlakukan, penyuntikan kelenjar
ludah mengandung sporozoit ini diulangi 2 minggu kemudian booster. b. Isolasi DNA hati dan limpa mencit.
Isolasi DNA dilakukan menggunakan kit QIAGEN. Sampel hati 25 mg dan limpa 10 mg dipotong-potong menjadi bagian yang lebih kecil menggunakan
pinset. Sampel dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan 180 µl tissue lysis buffer. Selanjutnya sampel ditambahkan 20 µl Proteinase-K, divorteks,
dan diinkubasi pada suhu 56°C selama 1 jam sampai jaringan mengalami lisis. Selama waktu inkubasi dilakukan 2-3 kali vorteks . Pengendapan pelet dilakukan
dengan cara disentrifus sebentar. Kemudian ditambahkan 4 µl RNA-se 100 mgml, divorteks 15 detik dan diinkubasi 2 menit pada suhu kamar. Kemudian
pada tabung ditambahkan 200 µl lysis buffer, lalu divorteks lagi selama 15 detik, diinkubasi pada suhu 70°C selama 10 menit. Selanjutnya tabung ditambahkan 200
µl etanol absolut, divorteks lagi selama 15 detik, disentrifus sebentar kemudian
dipindahkan dengan hati-hati ke dalam tabung QIAamp Mini Spin dan disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke QIAamp Mini spin kolom baru. Selanjutnya supernatan ditambahkan 500 µl buffer Wash buffer1 tanpa
membasahi dinding, disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Hasilnya dipindahkan ke dalam pada tabung QIAamp Mini spin yang bersih.
Kemudian supernatan ditambahkan 500 µl wash buffer2 tanpa membasahi dinding, disentrifus pada kecepatan 14000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang
dihasilkan dipindahkan pada tabung QIAamp Mini spin yang bersih dan disentrifus lagi pada kecepatan 14000 rpm selama 1 menit. Pada tahap ini sudah
didapatkan ekstrak DNA. Tabung QIAamp Mini spin ditempatkan pada tabung 1,5 ml kemudian ditambahkan 80 µl elution buffer dan diinkubasi pada suhu
ruang selama 5 menit, disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Ekstrak DNA yang sudah didapatkan kemudian disimpan pada suhu -20°C.
c. Amplifikasi DNA Tahap PCR untuk deteksi Plasmodium menggunakan 2 kali PCR yakni
nested-1 dan nested-2. Nested-2 dilakukan setelah diketahui hasil PCR pada nested-1. Primer yang digunakan untuk nested-1 adalah rPLU1 rPLU5 dengan
ukuran panjang DNA target sebesar 1640 bp Michael 2005 sedangkan primer pada nested-2 adalah rPLU3 rPLU4 dengan ukuran panjang DNA target
sebesar 240 bp Singh et al.1999. Produk PCR adalah gen 50S ribosomal sub unit L21.
PCR nested-1 menggunakan primer rPLU1 sebagai primer F dengan panjang 24 basa dan urutan basa 5’-TCA AAG ATT AAG CCA TGC AAG
TGA-3’, sedangkan rPLU 5 sebagai primer R dengan panjang 21 basa dan urutan basanya adalah 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TCC-3’. Pada Nested-2,
rPLU3 sebagai primer F mempunyai panjang 30 basa dengan urutan 5’-TTT TTA TAA GGA TAA CTA CGG AAA AGC TGT-3’ sedangkan rPLU4 sebagai
primer R mempunyai panjang 30 basa dengan urutan 5’-TAC CCG TCA TAG CCA TGT TAG GCC ATT ACC-3’.
Langkah awal adalah membuat larutan mix PCR dengan komposisi sebagai berikut. Perbandingan distillated water adalah 17,75 µl; Buffer A
sebanyak 2,5µl ; MgCl
2
1µl; dNTPs 0,5µl; primer F 0,25µl; primer R 0,25µl; Taq polymerase 0,25µl.
Semua komponen yang sudah dicampur di dalam tabung kemudian divorteks dan disentrifus sebentar. Setiap tabung PCR diisi campuran tersebut
sebanyak 22,5 µl. Sebanyak 3 µl ekstrak DNA dimasukkan ke dalam masing- masing tabung PCR dan diberi label. Tabung divorteks sebentar agar tidak ada
komponen yang menempel pada dinding tabung. Kemudian semua tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR GeneAmp® PCR System 9700 Applied
Biosystem yang sudah dihidupkan terlebih dahulu. Kondisi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut.
Kondisi PCR untuk nested-1:
a Pre denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit. b Siklus sebanyak 29 kali terdiri denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik,
annealing pada suhu 55°C selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72°C selama 1 menit.
c Post elongasi pada suhu 72°C selama 4 menit.
Kondisi untuk nested-2: a Pre denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit
b Siklus sebanyak 30 kali terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, annealing pada suhu 62°C selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72°C
selama 1 menit c Post elongasi pada suhu 72°C selama 4 menit.
d. Elektroforesis gel agaros hasil isolasi dan amplifikasi DNA Elektroforesis dilakukan pada ekstrak DNA dan sampel produk PCR.
menggunakan gel agaros 2. Produk ekstraksi DNA dielektroforesis dengan perbandingan sampel : loading buffer adalah 4: 2. Produk PCR dielektroforesis
dengan perbandingan sampel : loading buffer adalah 8: 3. Sampel yang sudah dicampur dengan loading buffer dimasukkan ke dalam sumur gel agaros yang
direndam dalam TBE 0,5 X. Gel kemudian di-running selama 30 menit pada 50 Volt. Selanjutnya gel direndam dengan larutan yang mengandung ethidium
bromide EtBr selama 15 menit sambil digoyang menggunakan shaker dan direndam dengan aquades sambil digoyang selama 10 menit. Visualisasi pita
dilakukan DNA menggunakan Gel Doc yang sudah dilengkapi software Image Lab.
G. Data dan Metode Pengumpulan Data
Kategori