pada stadium sporozoit. Hal ini dibuktikan oleh berkurangnya kemampuan infeksi Plasmodium sampai ke sel-sel hati.
3. Analisis DNA dengan Teknik Nested-PCR
a. Molekul DNA DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA di dalam sel berupa DNA mitokondria, DNA kloroplas dan DNA inti.
Keseluruhan DNA yang menyusun masing- masing komponen disebut DNA genom Muladno 2002.
P. berghei memiliki 14 kromosom. Secara analisis molekuler P. berghei sama seperti Plasmodium yang menginfeksi manusia. P. berghei mempunyai genom
berukuran 2,3-2,4 x10
7
pb. DNA inti P. berghei mengandung A+T yang tinggi sekitar 82 yang tersebar pada DNA koding dan DNA non-koding. Genom P.
berghei mengandung G+C sekitar 25-30 . Plasmodium mempunyai sekitar 5300 gen yang mengkode berbagai protein yang berperan dalam metabolisme, transpor
materi organik, replikasi-perbaikan-rekombinasi DNA dan lain-lain. Selain itu parasit mempunyai gen pengkode enzim sebagai biokatalis dan transport protein Gardner et
al. 2002. b. Teknik Nested-Polymerase Chain Reaction
Teknik PCR telah digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit infeksi Sulistyaningsih 2007. Nested-PCR merupakan metode amplifikasi sekuens DNA
yang spesifik secara invitro. Teknik ini menggunakan dua kali proses amplifikasi dengan 2 pasang primer yang spesifik. Pasangan primer pertama berfungsi
menggandakan fragmen seperti PCR standar, sedangkan pasangan primer kedua berfungsi untuk memperkuat suatu fragmen DNA produk PCR pertama. Keuntungan
dari nested PCR adalah jika terdapat kesalahan amplifikasi fragmen, maka akan diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh sepasang primer pada nested-2.
Amplifikasi metode PCR memerlukan beberapa macam bahan yaitu: a primer, suatu oligonukleotida tunggal yang sekuensnya berkomplemen dengan
cetakan DNA dan panjangnya antara 18-30 basa, b enzim Taq DNA polymerase, c dNTPs dATP, dCTP, dGTP, dTTP, DNA target, akuabides, dan buffer PCR yang di
dalamnya sudah terdapat garam magnesium Sulandari Zein 2003. Prinsip PCR ada tiga, yaitu denaturasi yang berarti pemutusan untai ganda menjadi untai tunggal,
annealing yakni penempelan primer pada tempat yang spesifik dan elongasi yaitu pemanjangan primer dengan bantuan enzim DNA polymerase membentuk untaian
DNA. Ilustrasi PCR dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2 Gambaran skematis nested-PCR Pooe 2011 Nested-PCR adalah teknik yang lebih akurat dibandingkan pemeriksaan
mikroskopis. Nurhayati et al. 2009 mengkaji tentang penggunakan mikroskop yang selama ini menjadi standar emas gold standar dalam pemeriksaan Plasmodium yang
dinilai sekarang kurang akurat. Diagnosis parasit tidak cukup hanya mengandalkan teknik mikroskopis saja dikarenakan perubahan morfologi dan munculnya berbagai
strain baru yang disebabkan obat anti-malaria yang digunakan secara tidak tepat sehingga parasit menjadi resisten terhadap obat.
a First PCR amplification
Target gene sequence
b
c Second PCR amplification
Whole genom
Berbagai jenis Plasmodium dapat dibedakan dalam beberapa tahap perkembangannya. Plasmodium dapat dibedakan melalui bentuk skizon, trofozoit,
dan bentuk gametosit. Setiap Plasmodium mempunyai bentuk spesifik tetapi pemeriksaan mikroskopis masih cukup sulit dan membutuhkan ketelitian yang tinggi.
Selain pemeriksaan mikroskopis juga digunakan metode immunokromatografi yang lebih mudah, cepat dan ekonomis dibandingkan secara mikroskopis tetapi
keakuratannya masih kurang jika dibandingkan dengan PCR Arum et al. 2006. Contoh elektroforegram nested-2 dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Produk amplifikasi nested-2 Plasmodium sp dari sampel darah Singh et al. 1999
Metode lain untuk mendeteksi protein atau asam nukleat telah dikembangkan. Teknik dip-stick digunakan untuk mendeteksi secara immunoenzimatik protein yang
kaya histidin II yang spesifik pada P. falciparum. Selain itu deteksi berdasarkan asam nukleat yakni hibridisasi DNA atau RNA berlabel yang sensivitasnya
ditingkatkan dengan PCR juga dikembangkan. Kelebihan menggunakan PCR adalah dapat mendeteksi Plasmodium dalam tingkat infeksi ringan dengan hasil yang lebih
akurat Saiwichai et al. 2009.
B. Hipotesis
Kategori