8 misalnya suhu panas dan pH ekstrim. Penentuan daya tahan enzim terhadap
panas umumnya dilakukan pada suhu optimum dan pH optimum enzim tersebut Suhartono, 1989. Adanya perbedaan sumber atau asal enzim dapat
menyebabkan perbedaan terhadap daya tahan panas enzim tersebut meskipun jenis enzimnya sama Winarno, 1983. Tabel 6 menunjukkan beberapa
karakteristik dari enzim kitosanase.
C. MIKROBA TERMOFILIK
Mikroba termofilik merupakan mikroba yang mampu tumbuh optimal pada lingkungan ekstrim panas yaitu daerah-daerah geotermal di darat
maupun di laut dalam. Mikroba termofil dapat lebih tahan pada suhu tinggi disebabkan oleh keistimewaan yang dimiliki pada membran selnya yang
berhubungan dengan lingkungan luar. Diduga asam lemak penyusun komponen membran lebih jenuh sehingga membuat membran ini lebih stabil dan tahan
pada suhu tinggi. Mengingat beraneka ragam kehidupan mikroba, maka mikroba diklasifikasikan berdasarkan suhu pertumbuhan optimalnya pada tabel
3. Tabel 3. Klasifikasi mikroba berdasarkan suhu
Klasifikasi Suhu Pertumbuhan
Minimum °C Optimum °C
Maksimum °C
Psikrofil 0 – 5
5 – 15 15 – 20
Mesofil 10 – 20
20 – 40 40 – 45
Termofil 25 – 45
45 – 60 60 – 80
Prescott et al., 2003 Bacillus licheniformis MB-2 merupakan salah satu jenis mikroba
termofil yang menghasilkan enzim kitosanase. Berdasarkan identifikasi mikroba yang telah dilakukan oleh Chasanah 2004, Bacillus licheniformis
MB-2 merupakan jenis bakteri gram positif dan bersifat aerobik atau anaerobik. Spora dari mikroba ini berbentuk oval, bisa memanfaatkan glukosa,
maltosa, dan pati sebagai sumber karbonnya, memberikan hasil positif pada
9 reaksi katalase
serta hasil negatif pada reaksi indole, methyl red, dan voges preusker.
D. PEMURNIAN ENZIM 1. Pemurnian Kitosanase
a. Umum
Pemurnian merupakan suatu usaha untuk mengisolasi enzim tertentu dari ekstrak enzim kasar yang masih mengandung sel
mikroorganisme ataupun komponen lainnya Hooper Homes, 2000.
Walsh 2002 menggolongkan metode kromatografi menjadi empat yaitu kromatografi ion exchange, kromatografi interaksi hidrofobik,
kromatografi afinitas, dan kromatografi filtrasi gel. Kromatografi ion exchange adalah pemisahan protein yang
memanfaatkan perbedaan afinitas molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa pengisi kolom yang muatannya berlawanan Harris dan
Angal, 1989. Suhartono 1989 berpendapat bahwa ada dua macam bahan penukar ion yaitu bahan penukar kation dan bahan penukar anion.
Contoh penukar kation adalah Dowex 50, IRC-150, CM-selulosa, sephadex, dan sulfoetil selulosa. Sedangkan contoh penukar anion adalah
aminoetil, DEAE dietil-aminoetil, dan quartener-aminoetil. Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan pemisahan protein
berdasarkan adanya perbedaan interaksi hidrofobik antara larutan protein dan matriks gel sebagai fase diamnya. Jenis matriks yang biasa
digunakan adalah turunan dari sepharose seperti fenil sepharose Suhartono, 1989.
Kromatografi afinitas merupakan tipe kromatografi adsorpsi Scouten, 1942. Dalam hal ini molekul yang akan dimurnikan secara
khusus dan bersifat reversibel diadsorpsi oleh ikatan komplemen ligan yang terikat pada matrik. Sedangkan Kromatografi gel filtrasi
merupakan jenis metode pemurnian yang memisahkan larutan protein berdasarkan berat molekul Walsh, 2002. Pada tabel 5 dapat dilihat
10 beberapa tahap pemurnian enzim kitosanase yang dihasilkan dari
berbagai sumber mikroba yang berbeda.
b. Kromatografi filtrasi gel
Kromatografi filtrasi gel digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul tinggi dari protein atau molekul lain
dengan berat molekul rendah, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul. Prinsip dari filtrasi gel yaitu digunakanya bahan pengisi berupa
gel yang berpori-pori, dimana pori-pori pada permukaan gel ini cukup untuk mencegah molekul-molekul besar masuk kedalamnya tetapi hanya
dapat menampung molekul-molekul kecil. Pada filtrasi gel, campuran protein di dalam larutan dialirkan kedalam kolom butiran kecil berpori
dari polimer hidrofilik, sehingga molekul besar akan terelusi keluar kolom lebih cepat daripada molekul kecil karena molekul besar tidak
dapat berpenetrasi ke dalam granula-granula filtrasi gel tetapi hanya melalui sisi granula saja. Sedangkan molekul kecil dapat berpenetrasi ke
dalam granula-granula filtrasi gel sehingga molekul kecil terperangkap didalamnya, menyebabkan molekul kecil terelusi keluar lebih lambat
daripada molekul besar. Akan tetapi protein yang memiliki berat molekul menengah akan mengalir kebawah dengan kecepatan antara
tergantung pada tingkat kemampuan menembus butiran Lehninger, 1993. Filtrasi gel merupakan metoda pemurnian yang dipilih pada
penelitian ini. Mekanisme pemisahan molekul di dalam kolom filtrasi gel dapat dilihat pada gambar 3.
11 Gambar 3. Mekanisme pemisahan molekul pada kolom gel filtrasi
http:www.imb-jena.de...proteins_purification.html
Menurut Darwis dan Sukara 1989 beberapa jenis gel yang dapat dipakai dalam filtrasi gel antara lain dekstran, poliakrilamida,
polistirena, agarosa, selulosa, silikat, serta pore glass. Jenis gel yang paling umum digunakan adalah dekstran yang secara komersial dikenal
dengan nama sephadex. Sephadex merupakan polisakarida dekstran yang berikatan silang dengan epiklorohidrin yang mengandung sejumlah besar
gugus hidroksil. Gel ini mempunyai sifat tahan terhadap garam atau basa, namun rusak oleh asam di bawah pH 2 dan oksidator kuat
Suhartono, 1989. Tipe dari sephadex menentukkan kisaran ukuran yang dapat dipisahkan. Beberapa tipe gel sephadex dan ukuran molekul
yang dapat dipisahkan dapat dilihat pada tabel 4.
250 kDa 125 kDa
75 kDa Campuran protein
Volume elusi Pori matriks
Jumlah protein
12 Tabel 4. Beberapa tipe dari gel sephadex
Tipe Gel
Nilai pengikatan air gg sephadex
kering Batas
pengeluaran BM Dalton
Kisaran fraksinasi
Dalton
G-10 1.0 700
- 700
G-25 2.5
5000 100 – 5000
G-50 5.0
10.000 500 – 10.000
G-75 7.5 50.000
1000 –
50.000 G-100
10.0 100.000
5000 – 100.000 G-200
20.0 200.000
5000 – 200.000 Mangunwidjaja 1988
Huruf G dibelakang nama sephadex menunjukkan bahwa sephadex tersebut dikembangkan dengan air. Sedangkan nomor dibelakangnya
menunjukkan besarnya pengembangan tersebut. Misalnya, 25 kali, 50 kali, dan sebagainya Suhartono, 1989. Gambar 4 menunjukkan struktur
dari sephadex.
Gambar 4. Struktur sephadex
http:ead.univangers.fr...1GelSephadex.htm
13
2. Pemurnian Kitosanase yang telah dilakukan
Tahapan pemurnian kitosanase yang telah berhasil dilakukan tertera pada tabel 5.
Tabel 5. Tahap pemurnian enzim kitosanase
Sumber Tahapan Acuan
Bacillus cereus 1.
Presipitasi PEG 22 2.
Cation exchange s- sepharose
Piza et al., 1999
Bacillus sp. Strain KCTC 0377 BP
1. Dialisis PEG
2. Anion exchange CM-
Toyopearl Choi et al., 2004
Bacillus coagulans LH 28.38
1. Presipitasi amonium
sulfat 80 2.
Filtrasi gel sephadex G- 100
Haliza, 2003
Bacillus circulans MH-K1
1. Presipitasi amonium
sulfat 70 - 90 2.
Dialisis Bufer Tris Malat 0.02 M pH 6.2
3. Anion exchange CM-
selulosa dan HPLC Yabuki, 1989
Bacillus licheniformis UTK
1. Presipitasi amonium
sulfat 60 – 90 2.
Filtrasi gel sephadex G- 50 dan sephadex G-100
Uchida, 1992
Mucor rouxi 1.
Presipitasi amonium sulfat 85
2. Ion exchange CM-
Sephadex dan DEAE Sephadex
Arcidiacono et al., 1989
Matsuebacter chitosanotabidus
1. Presipitasi amonium
sulfat 70 Park et al., 1999
14 3001
2. Dialisis Bufer Tris-HCl
20 mM pH 8.0 3.
Kromatografi isoelectric LKB-Produkter
Aspergilus fumigatus KB-1
1. Dialisis Bufer sodium
asetat 10 mM pH 5.0 2.
Kromatografi anion exchange
Eom dan Kang, 2003
E. SDS-PAGE PAGE dengan Sodium dodesil sulfat
Teknik SDS-PAGE merupakan metode yang sudah lama digunakan secara luas untuk menentukkan berat molekul. Selain itu SDS-PAGE
pun digunakan untuk memonitor pemurnian protein dan mendeteksi penggunanaan pemalsuan bahan-bahan Nur dan Adijuwana, 1987. SDS-
PAGE adalah metoda yang murah, mudah dibuat, dan cepat untuk menentukkan, membandingkan, dan mengkarakterisasi protein Bollag dan
Edelstein, 1991. SDS-PAGE merupakan pemisahkan fraksi-fraksi suatu zat
berdasarkan migrasi partikel bermuatan atau ion-ion makromolekul dibawah pengaruh medan listrik, dimana migrasi partikel bermuatan dapat terjadi karena
perbedaan ukuran, bentuk, dan muatan Harris Angal, 1989. SDS CH
3
-CH
2 10
-CH
2
OSO
3 -
Na
+
merupakan detergen anionik dan merupakan grup ion sulfat. Disamping itu SDS pun sebagai bahan
pendenaturasi protein bila dipanaskan bersama dengan β-merkaptoetanol
selama 100°C selama 3 menit. Pemanasan menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini disebabkan oleh
terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus sulfihidril. Gel poliakrilamida diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamida
dengan sejumlah cross linking agent metilena bis akrilamida dan amonium persulfat APS sebagai inisiator. Radikal-radikal bebas yang terbentuk dari
amonium persulfat dalam air akan bereaksi dengan akrilamid, dalam hal ini
15 akan terjadi penyimpanan radikal bebas di dalam molekul akrilamid sehingga
terbentuk akrilamid aktif. Akrilamid aktif ini dapat bereaksi dengan cara yang sama dengan molekul akrilamid yang lain sehingga dihasilkan suatu rantai
polimer yang panjang. Larutan dari rantai polimer ini meskipun kental viscous, tapi tidak membentuk gel. Untuk membentuk gel diperlukan N, N’-
metilen-bis-akrilamida yang bertindak sebagai cross linking agent. Polimerisasi menyebabkan jala dari rantai akrilamida. Ukuran pori jala tersebut ditentukkan
oleh jumlah akrilamida yang dipergunakan per unit volume medium reaksi T dan derajat ikatan silangnya C Nur dan Adijuwana, 1988. Adapun
mekanisme dari pembentukan gel poliakrilamida dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Pembentukan gel poliakrilamida
http:www.davidson.edu...MolbioSDSPAGESDSPAGE.html
Analisa hasil elektroforesis SDS-PAGE pada umumnya didasarkan pada elektroforetik protein. Mobilitas suatu partikel adalah kecepatan yang
dicapai oleh partikel tersebut pada suatu medan listrik dan mobilitas relatif suatu protein merupakan perbandingan jarak antara titik awal ke pita protein
dengan titik awal ke titik akhir elektroforesis Suhartono, 1989 dan Nur Adijuwana, 1988. Dimana penentuan berat molekul protein ditentukkan
Matriks poliakrilamida
16 dengan membuat hubungan antara log berat molekul dan mobilitasnya Nur dan
Adijuwana, 1988. Tabel 6. Beberapa karakteristik enzim murni kitosanase
Sumber Suhu Optimum
°C pH
Optimum Berat
Molekul kda
Acuan
Bacillus cereus 54 5.8
47 SDS-
PAGE Piza et al.,
1999 Bacillus sp.
strain KCTC 0377 BP
60 4 – 6
45 SDS- PAGE
Choi et al., 2004
Bacillus circulans
MH- K1
50 6.5
32 SDS- PAGE
27 HPLC- gel filtrasi
Yabuki, 1989
Bacillus licheniformis
UTK 45
6.9 31 SDS-
PAGE 26 Filtrasi
gel-sephadex G-100
Uchida, 1992
Bacillus coagulans
LH 28.38
60 - 70 8 – 11
74 – 87 SDS-PAGE
Haliza, 2003
Matsuebacter chitosanotabidus
3001 30 - 40
4.0 34 SDS-
PAGE Park et al.,
1999 Bacillus subtilis
168 csn 60
5 – 7 29 SDS-
PAGE Rivas et al.,
1999 Bacillus
megaterium P1 45
4.5 – 6.5 43, 39.5, dan
22 SDS- PAGE
Pelletier dan Sygusch,
1992
17 Bacillus sp.
Strain CK4 60 6.5
29 SDS-
PAGE Yoon et al.,
2000 Aspergillus
fumigatus KB-1 60 dan 70
5.5 – 6.5 25.5 SDS-
PAGE Eom dan
Kang, 2003
18
III. METODOLOGI PENELITIAN A.
BAHAN DAN ALAT 1.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari : 1 isolat bakteri Bacillus licheniformis MB-2 yang merupakan koleksi
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PAU Institut Pertanian Bogor. 2 Tepung kitin Rajungan dan substrat terdiri dari : kitosan dan koloidal kitosan
Haliza, 2003 lampiran 1 dan 2, soluble kitosan disiapkan dari metoda Chasanah 2004 lampiran 3. 3 Bahan-bahan kimia untuk media padat
Chasanah, 2004 dan thermus media cair yang disiapkan dari metoda Park et al., 1999 yaitu K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, MgSO
4
, ekstrak khamir, casiton, bacto agar, dan gelrite 4 Reagen terdiri dari larutan schales dan larutan bradford
lampiran 7 5 Bahan kimia untuk pembuatan kurva standar adalah glukosamin, BSA Bovine serum Albumin 6 Amonium sulfat, Na-karbonat,
dan EDTA digunakan untuk tahap presipitasi dan dialisis 7 Sephadex G-100 digunakan untuk kolom kromatografi metode filtrasi gel 8 Bufer terdiri dari
bufer asetat, bufer fosfat, bufer universal, bufer sitrat, bufer fosfat sitrat, bufer tris lampiran 6, bufer elektroforesis dan bufer sampel lampiran 7 9
Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk SDS-PAGE terdiri dari larutan A, larutan B, larutan C, larutan fiksasi, silver nitrat, Na
2
CO
3
, APS amonium persulfat, TEMED N,N,N’,N’-tetrametil diamin, aquabidestilata, etanol
30 dan 50, formaldehida, larutan enhancer, marker pharmacia lampiran 7. semua bahan yang digunakan dalam penelitian ini
berspesifikasi pro-analisis p.a.
2. Alat
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah peralatan yang berada di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PAU Institut Pertanian
Bogor antara lain: neraca analitik, ruang dingin cool room, bunsen, oven, autoklaf, mesin pengering beku, spektrofotometer, kantong dialisis dari
selofan berukuran 10.000 dalton, kolom kromatografi pharmacia panjang
