EKSTRAKSI HASIL DAN PEMBAHASAN A. PRODUKSI ENZIM

34 pereduksi glukosamin yang terbentuk karena reaksi hidrolisis substrat dengan soluble kitosan oleh komplek enzim kitosanase. Gula pereduksi yang terbentuk akan mereduksi reagen schales yang mengandung ferrycyanide, dimana bentuk ferri dari besi akan tereduksi menjadi bentuk ferro membentuk larutan berwarna putih dan nilai absorbansi diukur pada panjang gelombang 420 nm. Aktivitas supernatan bebas sel dari enzim kitosanase adalah 1.076 Uml dengan aktivitas spesifik 4.538 Umg. Aktivitas supernatan bebas sel yang diperoleh pada penelitian ini lebih besar dibandingkan penelitian sebelumnya. Chasanah 2004 mendapatkan aktivitas kitosanase dari isolat Bacillus licheniformis MB-2 sebesar 0.8 Uml dengan waktu panen 7 hari pada suhu inkubasi 55 o C. Adanya perbedaan aktivitas supernatan bebas sel dengan penelitian sebelumnya, kemungkinan disebabkan oleh adanya perbedaan faktor yang mempengaruhi lingkungan fermentasi seperti penciptaan kondisi aseptis saat fermentasi dan adanya perbedaan waktu inkubasi isolasi mikroba pada media padat. Perbandingan aktivitas supernatan bebas sel dengan kitosanase lain terlihat pada tabel 10.

B. EKSTRAKSI

Kerja enzim sering terganggu karena adanya kontaminan, sehingga agar terhindar dari kontaminan tersebut maka perlu dilakukan ekstraksi enzim sebelum melakukan tahap pemurnian. Proses ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini meliputi tahap presipitasi dan dialisis.

1. Presipitasi

Presipitasi merupakan tahap penambahan reagen sehingga terjadi pengendapan protein. Reagen yang biasa digunakan adalah garam amonium sulfat, sodium sulfat, pelarut organik metanol, etanol, isopropanol, dan polimer organik Harris dan Angal, 1989. Reagen yang dipilih pada penelitian ini adalah garam amonium sulfat karena metode presipitasi yang digunakan adalah presipitasi dengan peningkatan kekuatan ion salting out. Menurut Suwanto et al., 1991 keuntungan menggunakan garam amonium sulfat adalah kelarutannya tinggi dalam air, 35 harganya murah, tidak dipengaruhi struktur protein, tidak memberi pengaruh yang berarti pada enzim, dan tidak beracun. Amonium sulfat ditambahkan dengan konsentrasi yang tinggi yaitu 80 amonium sulfat jenuh dan bentuk garam yang ditambahkan berupa bahan padat. Dimana penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi tinggi menyebabkan peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik mantel air dari koloid protein, sehingga interaksi hidrofobik diantara sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan menurunkan kelarutan protein salting out. Haliza 2003 melaporkan bahwa amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 80 memberikan aktivitas yang optimum bagi enzim kitosanase. Penambahan amonium sulfat pada kondisi jenuh dimaksudkan agar terdapat kumpulan molekul protein bila telah melewati titik jenuh. Amonium sulfat ditambahkan sedikit demi sedikit dan diatur dengan menggunakan magnetic stirrer, hal ini bertujuan agar kontak antara enzim dengan garam dapat berlangsung dengan baik. Proses salting out tergantung pada ikatan hidrofobik yang ada pada bagian dalam protein. Dimana saat garam ditambahkan, air akan melarutkan ion garam dan terjadinya peningkatan konsentrasi garam sehingga air lepas dari sekitar protein menyebabkan hydrophobic patches. Hydrophobic patches dari suatu protein dapat berinteraksiberikatan dengan yang lain menghasilkan endapan, dimana protein yang hydrophobic patches lebih besar akan mengendap sebelum yang lebih kecil Harris Angal, 1989. Proses presipitasi dilakukan pada kondisi dingin untuk mengurangi inaktifasi misalnya oleh protease endogenous, dimana penigkatan suhu akibat proses pelarutan dengan bantuan magnetic stirrer dapat menyebabkan denaturasi. Proses pengendapan disempurnakan dengan menyimpan enzim yang telah ditambahkan amonium sulfat selama semalam pada suhu 4°C. Selama proses penyimpanan molekul-molekul protein beragregasi tetapi tidak langsung semua mengendap, sebagian agregat protein melayang dan terkumpul di bagian permukaan membentuk suatu lapisan. Presipitat crude enzyme diperoleh dengan cara sentrifugasi pada suhu 4°C selama 36 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian pelarutan hasil sentrifugasi dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.0 dan larutan enzim yang dihasilkan kemudian diukur aktivitas dan kadar proteinnya. Aktivitas enzim dan konsentrasi protein setelah presipitasi mengalami peningkatan menjadi 1.087 Uml gambar 8 dengan konsentrasi protein sebesar 0.759 mgml. Hal ini dapat dimengerti karena yang diendapkan oleh amonium sulfat adalah protein enzim dan protein-protein lain. Namun peningkatan yang terjadi pada aktivitas katalitik enzim dan jumlah protein enzim tidak diikuti dengan peningkatan aktivitas spesifik enzim. Aktivitas spesifik enzim setelah presipitasi mengalami penurunan yang cukup besar dari 4.539 Umg menjadi 1.433 Umg. Hal ini diduga karena adanya protease endogenous dan kemungkinan adanya sisi aktif enzim yang terdenaturasi. Penurunan yang terjadi pada aktivitas spesifik enzim menyebabkan tingkat kemurnian enzim pun ikut menurun menjadi 0.32 kali. 1.07 1.072 1.074 1.076 1.078 1.08 1.082 1.084 1.086 1.088 Supernatan bebas sel Crude enzim Dialisat A k ti v ita s U m l Gambar 8. Aktivitas enzim kitosanase hasil ekstraksi

2. Dialisis

Menurut Copeland 1994 dialisis merupakan proses yang dilakukan untuk memisahkanmenghilangkan molekul garam amonium sulfat dan ion-ion penggangu lainnya yang berpengaruh terhadap kestabilan molekul protein enzim selama penyimpanan, dimana molekul- molekul kecil dan ion-ion akan melewati pori-pori selaput semipermeabel dan keluar dari kantong dialisis. Sedangkan menurut Hooper dan Homes 37 2000 dialisis merupakan proses difusi selektif yang melewati membran semipermeabel dan merupakan metode yang paling dikenal untuk menghilangkan molekul-molekul pengganggu berukuran kecil dan menggantikannya dengan larutan bufer yang masuk ke dalam dialisat. Pada awal dialisis karena konsentrasi garam di dalam kantong yang lebih tinggi daripada di luar kantong menyebabkan bufer masuk ke dalam kantong. Selanjutnya garam akan keluar dari kantong hingga tercapai kondisi keseimbangan dimana konsentrasi garam di dalam dan di luar kantong sama gambar 9. Proses dialisis dilakukan dengan memasukkan enzim kedalam kantong dialisis dan merendamnya dalam larutan bufer. Kantong yang digunakan adalah kantong selofan berukuran 10.000 dalton. Selofan merupakan turunan dari membran selulosa yang akan menahan molekul yang memiliki berat molekul lebih dari 10.000 dalton. Perebusan ke dalam larutan EDTA dan sodium karbonat dilakukan terhadap kantong selofan sebelum kantong selofan tersebut digunakan. Adapun tujuan perebusan adalah untuk menghilangkan protein yang mungkin menempel di kantong dan untuk menghindari kontaminasi dari bahan kimia selama proses pabrikan. Bufer yang digunakan adalah bufer fosfat 0.05 M pH 6.0. Proses dialisis dilakukan selama semalam pada suhu 4°C agar tidak terjadi kerusakan enzim. Teknik dialisis dikatakan berhasil bila larutan bufer pendialisis menampakkan warna yang sama seperti sebelum dilakukannya proses dialisis. Gambar 9. Prinsip dialisis http:www.imb-jena.de...proteins_purification.html Kantong dialisis Konsentrasi larutan Bufer Awal Dialisis Akhir Dialisis 38 Dari hasil analisa, aktivitas enzim dan konsentrasi protein setelah dialisis mengalami penurunan menjadi 1.086 Uml gambar 8 dan konsentrasi protein menjadi 0.531 mgml. Namun penurunan aktivitas enzim diikuti dengan peningkatan aktivitas spesifik enzim menjadi 2.045 Umg. Adanya penurunan aktivitas enzim diduga disebabkan oleh hilangnya kofaktor yang berupa ion logam yang penting untuk aktivitasnya dan diduga akibat adanya proteolisis endogenous. Penurunan kadar protein menunjukkan adanya sebagian protein lain yang memiliki berat molekul kurang dari 10.000 dalton bermigrasi keluar membran. Sedangkan peningkatan aktivitas spesifik menunjukkan telah berkurangnya komponen protein non enzim. Peningkatan aktivitas spesifik menyebabkan tingkat kemurnian setelah dialisis mengalami peningkatan menjadi 0.45 kali, hal ini menunjukkan bahwa molekul-molekul yang mengotori telah berkurang dan tingkat kemurnian pun akan semakin meningkat dengan melakukan beberapa metode pemurnian yang lebih selektif seperti dengan metode kromatografi. Tabel 10. Perbandingan aktivitas enzim dengan kitosanase lain Sumber Jenis enzim Aktivitas atau aktivitas spesifik Acuan Bacillus licheniformis MB-2 1. Supernatan bebas sel waktu panen 7 hari, 55 o C 2. Crude enzyme amonium sulfat 80 3. Dialisat 1.076 Uml, 4.539 Umg 1.087 Uml, 1.433 Umg 1.086 Uml, 2.045 Umg Penelitian ini Bacillus lichenifromis MB-2 Supernatan bebas sel waktu panen 7 hari, 55 o C 0.8 Uml Chasanah, 2004 Bacillus 1. Supernatan bebas sel 5.15 Umg Haliza, 2003 39 coagulans LH 28.38 waktu panen 7 hari, 55 o C 2. Crude enzyme amonium sulfat 80 65.39 Umg Bacillus circulans MH-K1 Supernatan bebas sel waktu panen 3 hari, 30 o C 4.0 Umg Yabuki, 1989 Bacillus licheniformis UTK 1. Supernatan bebas sel waktu panen 8 hari,30 o C 2. Crude enzyme amonium sulfat 60 – 90 3.28 Uml 124 Uml Uchida et al., 1992 Mucor rouxii Crude enzyme amonium sulfat 65 6.65 Umg Arcadiacono et al., 1989

C. PEMURNIAN Kromatografi Filtrasi gel