PEMURNIAN Kromatografi Filtrasi gel

39 coagulans LH 28.38 waktu panen 7 hari, 55 o C 2. Crude enzyme amonium sulfat 80 65.39 Umg Bacillus circulans MH-K1 Supernatan bebas sel waktu panen 3 hari, 30 o C 4.0 Umg Yabuki, 1989 Bacillus licheniformis UTK 1. Supernatan bebas sel waktu panen 8 hari,30 o C 2. Crude enzyme amonium sulfat 60 – 90 3.28 Uml 124 Uml Uchida et al., 1992 Mucor rouxii Crude enzyme amonium sulfat 65 6.65 Umg Arcadiacono et al., 1989

C. PEMURNIAN Kromatografi Filtrasi gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan metode pemisahan protein berdasarkan perbedaan berat molekul, dimana molekul ditempatkan secara partisi antara solven dan fase diam berpori. Solven yang dimaksud pada penelitian ini adalah bufer fosfat 0.05 M pH 6. Dimana proses pemisahan menggunakan filtrasi gel, matriks gel yang berpori dipak kedalam kolom dan dikelilingi oleh solven. Molekul besar akan lolos dari fase diam dan terelusi lebih awal, molekul sedang akan masuk kedalam fase diam tetapi punya waktu tinggal yang lebih sedikit dari molekul kecil dalam fase diam. Sedangkan molekul kecil akan terselusi paling akhir karena memiliki waktu tinggal yang paling lama di dalam fase diam Suhartono, 1989. Pada penelitian ini digunakan sephadex G-100. Dimana pemilihan matriks dilakukan berdasarkan kisaran berat molekul dari enzim yang akan dipisahkan. Sephadex G-100 memiliki kisaran fraksinasi antara 5 – 100 kDa sehingga matriks ini dianggap mempunyai kisaran fraksinasi yang cukup 40 untuk memisahkan kitosanase. Berdasarkan penelitian sebelumnya kitosanase memiliki berat molekul antara 22 – 87 kDa tabel 6. Sebelum matriks sephadex G-100 ini diaplikasikan kedalam kolom dilakukan tahap pengembangan swelling, dimana matriks dikembangkan dengan air dan kemudian matriks diagitasi. Adapun tujuan dari pengembangan matriks adalah agar matriks yang berbentuk butiran bisa mengendap dan membentuk gel bubur kental. Sifat gel yang baik adalah mudah mengendap, bersih, bebas gelembung udara, dan jernih,. Waktu pengembangan gel yang dilakukan pada penelitian ini adalah 3 hari 72 jam pada suhu dingin. Sedangkan tujuan dari agitasi adalah untuk menghilangkan gelembung udara pada gel yang telah dikembangkan, dimana gelembung udara dapat menghalangi jalannya enzim kedalam kolom dan dapat mengganggu proses pemurnian. Gel yang telah mengalami pengembangan diaplikasikan kedalam kolom dan diperoleh panjang gel dalam kolom sebesar 25 cm. Ekulibrasi dilakukan pada kolom yang telah berisi gel. Ekuilibrasi merupakan tahap pengaliran sejumlah bufer kedalam kolom sehingga dicapai laju aliran yang konstan. Hal yang paling utama dalam memilih larutan bufer adalah kestabilan molekul yang dikehendaki dalam bufer yang dipilih. Bufer yang ditambahkan ditampung dalam tabung reservoir sehingga pengaliran bufer kedalam kolom dilakukan secara otomatis dengan mengatur katup pada tabung reservoir. Selanjutnya enzim hasil dialisat dilewatkan pada kolom filtrasi gel setelah proses pengepakan matriks selesai. Waktu pemurnian filtrasi gel dilakukan selama 25 jam dengan kecepatan elusi 0.22 mlmenit dan sampel hasil pemurnian ditampung dalam 100 buah tabung sebanyak 3 ml untuk tiap tabung dengan menggunakan fraction collector. Pada grafik hasil kromatografi filtrasi gel terlihat adanya peak dari fraksi protein gambar 10, dimana Peak ini menandakan adanya enzim. Peak yang dimaksud pada gambar adalah protein enzim fraksi 9 yang memiliki aktivitas sebesar 1.049 Uml. Dari hasil penelitian diperoleh nilai aktivitas enzim yang lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas tahap sebelumnya dan juga didapatkan penurunan kadar protein menjadi 0.032 41 mgml. Hal ini menyebabkan peningkatan aktivitas spesifik enzim yang telah dimurnikan menjadi 32.284 Umg dan peningkatan kemurnian menjadi 7.112 kali tabel 11. Enzim Kitosanase hasil kromatografi filtrasi gel pada penelitian ini memiliki tingkat kemurnian yang tidak begitu besar dibandingkan dengan kitosanase lainnya tabel 11. Penelitian sebelumnya yaitu kitosanase dari isolat Bacillus licheniformis MB-2 dengan kromatografi interaksi hidrofobik memiliki tingkat kemurnian 9.5 kali F1 dan 25.8 kali F2 Chasanah 2004. Adanya perbedaan tingkat kemurnian dengan penelitian sebelumnya kenungkinan disebabkan karena perbedaan metode pemurnian yang digunakan. Dengan merujuk kepada tingkat pemurnian yang diperoleh, maka dapat dikatakan bahwa metode pemurnian interaksi hidrofobik lebih efektif dalam memisahkan protein enzim kitosanase dari protein non enzim dibandingkan dengan metode pemurnian filtrasi gel. Tabel 11. Produksi enzim kitosanase dari isolat Bacillus licheniformis MB-2 Tahapan Pemurnian [Protein] mgml Aktivitas Enzim Uml Aktivitas Spesifik Umg Tingkat Kemurnian Supernatan bebas sel 0.237 1.076 4.539 1 Crude enzyme 0.759 1.087 1.433 0.316 Dialisat 0.531 1.086 2.045 0.450 Fraksi 9 0.032 1.049 32.284 7.112 42 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 10 20 30 40 50 60 Fraksi protein A k ti vi tas U m l 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A 5 9 5 nm A 595 nm Aktivitas Uml Gambar 10. Profil elusi aktif kitosanase pada filtrasi gel sephadex G-100 Tabel 12. Perbandingan tingkat kemurnian dengan kitosanase lain Sumber Metode Pemurnian Tingkat kemurnian kali Acuan Bacillus licheniformis MB-2 Kromatografi filtrasi gel sephadex G-100 7.112 Penelitian ini Bacillus coagulans LH 28.38 Kromatografi filtrasi gel sephadex G-100 Fraksi A : 2.59 Fraksi B : 7.51 Fraksi C : 17.1 Haliza, 2003 Bacillus licheniformis MB-2 Kromatografi Interaksi hidrofobik butyl toyopearl F1 : 9.5 F2 : 25.8 Chasanah, 2004 Bacillus circulans MH-K1 Kromatografi HPLC- gel filtrasi 40 Yabuki, 1989 Bacillus Kromatografi filtrasi Uchida et 43 licheniformis UTK gel • sephadex G-50 • sephadex G-100 C1 :160 C2 : 242 C1 : 247 C2 : 245 al., 1992 Mucor rouxii Kromatografi ion exchange • CM-sephadex • DEAE-sephadex 22 70 Arcidiacono et al., 1989

D. KARAKTERISASI ENZIM 1. KARAKTERISASI ENZIM KASAR