METODA METODOLOGI PENELITIAN A.

20

B. METODA

Skema riset penelitian dapat dilihat pada gambar 6 : Gambar 6. Skema Riset Penelitian

1. Tahap penyegaran dan pembuatan kultur starter Rianti, 2003

Isolat bakteri Bacillus licheniformis MB-2 yang disimpan dalam freezer, didiamkan selama lima menit pada suhu ruang. Sebanyak satu ose bakteri diinokulasikan ke dalam media padat kemudian diinkubasi selama 5 Tahap penyegaran dan pembuatan kultur starter Produksi enzim : 1. Aktivitas enzim 2. Kadar protein Tahap pemurnian enzim : 1. Presipitasi 2. Dialisis 3. Kromatografi teknik filtrasi gel Elektroforesis SDS-PAGE Karakterisasi enzim Crude enzyme dan Pure enzyme : 1. Suhu Optimum 2. pH Optimum 3. Stabilitas panas Fraksi positif 21 hari pada suhu pertumbuhan 55 o C. Setelah itu dilihat areal beningzona bening. Hasil goresan zona bening diambil satu ose kemudian ditumbuhkan pada 150 ml media cair dan diinkubasi dalam shaker waterbath suhu 55 o C selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm. Media padat yang digunakan adalah 1.0 koloidal kitosan, 0.7 K 2 HPO 4 , 0.3 KH 2 PO 4 , 0.5 MgSO 4 , 0.25 yeast extract, 0.25 casiton, 1.5 bacto agar, dan 0.4 gelrite dengan pH media 6.0 Chasanah, 2004. Sedangkan media yang digunakan untuk pembuatan kultur starter adalah 0.4 koloidal kitosan, 0.5 MgSO 4 , 0.3 KH 2 PO 4 , 0.7 K 2 HPO 4 , 0.25 yeast extract, dan 0.25 casiton dengan pH media 7.0 Park et al., 1999.

2. Produksi enzim Chasanah, 2004

Sebanyak 15 ml kultur starter dari media starter diinokulasikan ke dalam 85 ml media cair. Kemudian diinkubasikan ke dalam shaker waterbath pada suhu 55 o C dengan kecepatan 120 rpm selama 7 hari. Media yang digunakan untuk produksi enzim sama dengan media yang digunakan untuk membuat kultur starter. Pemisahan biomassa dilakukan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit, selanjutnya filtrat yang berisi enzim diukur aktivitas dan kadar proteinnya.

3. Pengendapan protein dengan amonium sulfat Rianti, 2003

Pada tahap ini, enzim yang telah diproduksi diendapkan semalam pada suhu 4°C dengan amonium sulfat jenuh 80. Kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Endapan yang dihasilkan diambil dengan melarutkannya pada bufer fosfat 0.05 M pH 6, dengan perbandingan 1 : 1. Presipitat yang dihasilkan diukur aktivitasnya dan kadar proteinnya.

4. Dialisis Rianti, 2003

Kantong dialisis dipotong sesuai dengan ukuran yang diinginkan. Kemudian direndam dengan larutan 2 bv Na-Karbonat dan 0.05 bv EDTA dan direbus selama 10 menit. Larutan diganti dengan akuades dan 22 kembali direbus selama 10 menit hal ini dilakukan dua kali. Kantong dibiarkan terendam dalam larutan bufer yang akan digunakan dalam proses dan disimpan dalam ruang dingin. Salah satu ujung kantong diikat dengan benang jahit, lalu sebanyak 4 ml enzim hasil presipitasi dimasukkan ke dalam kantong. Karena selama dialisis volume larutan dapat meningkat, maka pengisian kantong tidak boleh terlalu penuh. Udara dikeluarkan dari kantong dan ujung yang lain diikat erat. Kantong berisi enzim ini kemudian dimasukkan dalam larutan bufer fosfat 0.025 M pH 6 dengan volume 100x volume filtrat. Dialisis dilakukan diruang dingin selama semalam dan dilengkapi dengan stirrer. Selanjutnya hasil dialisis diukur aktivitas dan kadar proteinnya.

5. Kromatografi filtrasi gel Haliza, 2003

a. Persiapan bahan pengepak Tahapan awal dalam kromatografi filtrasi gel adalah melakukan persiapan gel matriks dan kolom yang akan digunakan. Agar memperoleh gel yang bagus maka semua peralatan harus bersih dan kering, bufer dan air yang digunakan harus disaring terlebih dahulu. Matriks yang digunakan dalam filtrasi gel adalah sephadex G-100. Matriks terlebih dahulu harus dikembangkan swelling sebelum digunakan. Tahap pengembangan adalah dengan menimbang sebanyak 2,5 gram sephadex G-100 dilarutkan dalam 300 ml air bebas ion sambil diaduk dengan magnetic stirer perlahan selama 30 menit, kemudian didiamkan selama 3 hari pada suhu dingin atau selama 3 jam pada suhu 90°C. Kemudian matriks dicuci dengan bufer enzim dan diagitasi sampai gelembung udara hilang. b. Pembuatan kolom Pembuatan kolom dilakukan dengan cara menuangkan matriks gel sephadex G-100 secara perlahan tapi kontinyu. Jika terbentuk rongga udara, bagian luar kolom diketuk sehingga rongga udara tersebut hilang. Jika tinggi kolom gel yang diinginkan telah tercapai, bahan pengepak dibiarkan mengendap. Setelah kolom terbentuk kemudian dilakukan ekuilibrasi kolom 23 dengan mengalirkan sejumlah bufer fosfat 0.05 M pH 6 untuk mencuci kolom. Semua kegiatan pengepakan kolom dilakukan di ruang dingin. c. Separasi contoh Sebelum diaplikasikan ke dalam kolom, sampel enzim hasil dialisis dipekatkan terlebih dahulu. Selanjutnya 2 ml sampel enzim diaplikasikan di bagian atas kolom, kemudian didiamkan beberapa saat agar contoh mempunyai kesempatan untuk memasuki kolom. Kemudian secara perlahan bufer elusi yang berupa bufer fosfat 0.05 M pH 6 ditambahkan sampai memenuhi atas kolom dan diikuti dengan perhitungan laju elusi. Fraksi-fraksi yang keluar ditampung ke dalam 100 buah tabung reaksi dengan volume 3 ml dengan menggunakan fraction collector. d. Analisa fraksi Fraksi-fraksi yang telah ditampung, kemudian dianalisis kandungan protein dan aktivitas enzimnya. Kemudian fraksi yang memiliki aktivitas tinggi dikumpulkan dan dianalisa karakteristiknya, yaitu suhu optimum, pH optimum, dan stabilitas panas. Selain itu fraksi dengan aktivitas relatif tinggi dipersiapkan untuk tahap SDS-PAGE.

6. Analisa aktivitas enzim kitosanase Meidina, 2003

Analisis aktivitas enzim kitosanase didasarkan pada perhitungan gula reduksi yang diproduksi selama hidrolisis soluble kitosan. Campuran reaksi yang terdiri dari 100 µl soluble chitosan 1, 100 µl 0.05 M bufer fosfat pH 6.0 dan 100 µl larutan enzim diinkubasi selama 30 menit pada suhu 70 o C. Reaksi enzimatis dihentikan dengan membekukan campuran reaksi pada suhu -20 o C selama 15 menit. Sebanyak 200 µl dari campuran diatas direaksikan dengan 1 ml pereaksi schales dan 800 µl air bebas ion dalam tabung reaksi. Tabung ditutup dengan alumunium foil dan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit. Setelah didinginkan , larutan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm. Prosedur analisis aktifitas kitosanase dapat dilihat pada tabel 7. 24 Tabel 7. Prosedur analisa aktivitas enzim kitosanase Bahan Substrat µl Kontrol µl Blanko µl Bufer fosfat 0.05 M pH 6.0 100 100 - Soluble chitosan 1 100 100 - Enzim kitosanase 100 - - Inkubasi 30 menit 70 o C Freeze -20 o C selama 15 menit Campuran 200 133 - Enzim - 67 - Air bebas ion 800 800 1000 Pereaksi schales 1000 1000 1000 Dididihkan 15 menit Sentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit pada 4 o C Ukur absorbansi pada panjang gelombang 420 nm Untuk pengukuran kontrol dilakukan dengan prosedur yang sama seperti diatas, hanya saja penambahan 67 µl enzim dilakukan setelah reaksi enzimatis dihentikan, dan campuran reaksi yang diambil adalah sebanyak 133 µl. Sebagai blanko digunakan 1 ml air bebas ion direaksikan dengan 1 ml pereaksi schales. Untuk standar digunakan larutan standar glukosamin dengan konsentrasi 0 – 275 µgml dan dilakukan dengan prosedur yang sama seperti pada pengukuran sampel. Nilai absorbansi dari sampel, kontrol, dan blanko dimasukan ke dalam kurva standar sehingga dapat ditentukan jumlah glukosamin yang terkandung didalam sampel. Selanjutnya nilai glukosamin tersebut dimasukan ke dalam rumus untuk menentukkan unit aktivitas enzim, sedangkan penentuan aktivitas spesifik enzim dilakukan dengan cara membagi unit aktivitas dengan konsentrasi protein. Satu unit aktivitas kitosanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1µmol gula reduksi glukosamin tiap menit pada kondisi tertentu. 25 Unit aktivitas = 300 x Glc x 1 x 1000 x 1 Unitml 200 BM 100 30 GIc = [Absorbansi B-S – Absorbansi B-K – b]a Unitmg kitosan = Unit aktivitas [Protein] Keterangan : 300 : Volume sampel hasil reaksi enzimatis µl 200 : Volume sampel untuk reaksi schales µl GIc : Jumlah glukosamin sampel µg BM : Berat molekul glukosamin, yaitu 215,6 grammol 1000 : Faktor konversi dari µl ke ml 100 : Volume larutan enzimvolume larutan soluble chitosan µl 1100 : Konsentrasi soluble chitosan mgµl 30 : Waktu inkubasi menit a : Slope dari persamaan kurva standar glukosamin b : Intercept dari persamaan kurva standar glukosamin

7. Pengukuran konsentrasi protein Bradford, 1976

Sebanyak 100 µl sampel ditambahkan dengan 2 ml larutan bradford, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama lima menit. Protein akan diikat oleh Coomassie Brilliant Blue G-250 yang terdapat pada pereaksi bradford membentuk kompleks warna biru. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi protein sampel dihitung berdasarkan kurva standar yang dibuat dari Bovine Serum Albumin BSA.

8. SDS-PAGE Bollag dan Edelstein, 1991

Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan piranti elektroforesis mini vertikal. Tahapan dari elektroforesis SDS-PAGE adalah sebagai berikut : a. Pembuatan gel elektroforesis Cetakan gel berupa dua lempeng kaca berukuran 10,1 x 7,5 cm yang dihimpitkan dengan ketebalan kaca 0,75 mm. Diantaranya diletakan 26 pemisah spacer pada bagian tepi cetakan. Susunan ini dijepit dengan klip sehingga dapat diberdirikan. Klip tidak boleh melewati batas pemisah. Cetakan ini diletakkan di atas lempeng kaca yang datar. Selanjutnya dibuat larutan gel penahan dan gel pemisah dengan komposisi sebagai berikut : Tabel 8. Komposisi gel SDS-PAGE Bollag dan Edelstein, 1991 Bahan untuk gel pemisah separating gel dicampur satu persatu dengan memasukkan TEMED pada akhir campuran lalu diaduk dan dipipet perlahan kedalam lapisan kaca sambil diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara sampai 1.5 cm dari permukaan kaca lalu dibiarkan memadat sekitar ± 30 menit. Setelah gel memadat, perlahan dimasukkan campuran gel penahan stacking gel lalu masukkan sisir 10 sumur sebagai tempat sampel protein dan dibiarkan selama ± 30 menit hingga memadat. Setelah semua campuran diaplikasikan pada pelat kaca, dilakukan pengecekan apakah pelat kaca bocor atau tidak. b. Pelarian Sampel Sebelum diinjeksikan, sampel enzim hasil pemurnian dan crude enzyme dipekatkan kemudian dipanaskan terlebih dahulu selama ± 3 menit, begitu pula dengan larutan marker standar protein. Bufer sampel 5 μl direaksikan dengan 20 μl sampel enzim yang telah dipanaskan, kemudian ditempatkan pada eppendorf. Kemudian injeksikan 12 μl sampel pada sumur- Bahan Gel Pemisah Separating Gel 8 ml Gel Penahan Stacking Gel 4 ml Stock akrilamid larutan A 2.7 0.67 Larutan B 2.5 - Larutan C - 1.25 Aquades 4.8 3.0 APS 10 0.05 0.05 TEMED 0.5 0.5 27 sumur yang terdapat pada pelat kaca sampel menggunakan hamilton syinges, disertai dengan penginjeksian 10 μl marker standar protein. Marker yang digunakan adalah LMW low moleculer weight yang terdiri dari phosphorilase b 97 kD, albumin 66 kD, ovalbumin 45 KD, carbonic anhydrase 30 kD, tripsin inhibitor 20.1 kD, dan α-lactalbumin 14.4 kD. Setelah semua sampel diinjeksikan pada sumur-sumur pelat kaca, rangkailah alat elektroforesis dengan cara meletakkan alat elektroforesis pada wadah yang berisi es batu. Sebelum running masukkan bufer elektroforesis kedalam chamber. Running elektroforesis dilakukan pada 100 volt, 50 mA atau hingga sampel hampir memasuki bagian gel pemisah. Elektroforesis berlangsung sekitar 1,5 jam dan dilakukan sampai warna biru dari bromphenol blue mencapai ± 1 cm dari bagian bawah gel. c. Fiksasi dan pewarnaan Setelah elektroforesis selesai, gel dilepaskan dari pelat kaca dan direndam dalam larutan fiksasi 12 asam asetat dan 25 metanol selama 1 jam, kemudian direndam dalam 50 etanol selama 20 menit dan diganti dengan 30 etanol selama 2 x 20 menit, direndam dalam larutan enhancer selama 1 menit dan dicuci dengan aquabidestilata selama 3 x 20 menit. Setelah dicuci kemudian ditambahkan dengan larutan silver nitrat selama 30 menit kemudian dicuci dengan aquabidestilata selama 2 x 20 detik dan ditambahkan dengan larutan campuran Na 2 CO 3 dan formaldehida sampai terlihat pita-pita pada gel. Setelah itu untuk menghentikan reaksi pembentukan pita, gel direndam dalam larutan fiksasi.

9. Karakterisasi Kitosanase

a. Suhu Optimum Chasanah, 2004 Enzim kitosanase crude dan pure enzyme dianalisis pada berbagai suhu untuk menentukkan suhu optimum. Aktivitas enzim dianalisis pada suhu inkubasi 37, 60, 70, 80, dan 90°C. 28 b. pH Optimum Chasanah, 2004 Enzim kitosanase crude enzyme dianalisa dengan menggunakan 0.05 M bufer sitrat pH 3, 0.05 M bufer asetat pH 4, 5, 6, 0.05 M bufer fosfat sitrat pH 5, 0.05 M bufer sodium fosfat pH 6, 7, 8, dan 0.05 M bufer tris pH 8. Sedangkan enzim kitosanase pure enzyme dianalisis pada menggunakan bufer universal 0.05 M pada pH 4 sampai 12. Dimana crude dan pure enzyme dianalisa pada masing-masing suhu optimumnya. c. Stabilitas panas Haliza, 2003 Stabilitas panas dianalisa pada pure enzyme, berupa pengaruh suhu dan pH terhadap stabilitas enzim. Pengaruh suhu terhadap stabilitas enzim dilakukan dengan memanaskan enzim tanpa substrat dan bufer pada suhu 80 o C selama 0, 30, 60, 90, dan 120 menit dan pada suhu 90 o C selama 0, 60 dan 120 menit kemudian dianalisa menggunakan bufer fosfat 0.05 M pH 6. Sedangkan pengaruh pH terhadap stabilitas enzim dilakukan dengan memanaskan enzim dengan bufer universal pH 6.0 tanpa substrat pada suhu optimum enzim selama 0, 30, 60, 90, dan 120 menit. Pengukuran stabilitas enzim dinyatakan dalam nilai k, t 12 , dan Ea. Nilai k suatu enzim adalah konstanta laju deaktifasi enzim dari model eksponensial perubahan konsentrasi dan merupakan slope dari plot ln [C] terhadap waktu. ln [C] = -K [t] + ln [C o ] ............................................................ 1 [Co] = aktivitas enzim pada awal inkubasi [t] = waktu inkubasi Nilai t 12 suatu enzim adalah waktu inkubasi pada suhu tertentu yang menyebabkan aktivitas enzim tinggal 50 dari aktivitas semula. t12 = - ln 0.5 .......................................................................... 2 k Energi aktifasi Ea dapat ditetapkan secara grafik berdasarkan persamaan Arrhenius. Persamaan ini merupakan hubungan laju reaksi terhadap suhu absolut. Ea merupakan slope dari ln k terhadap suhu absolut 1T. 29 K = A o [e] -EaRT Persamaan Arrhenius ln k = -Ea [1T] + ln k o .......................................................... 3 R Keterangan : K : Konstanta laju deaktifasi T : Suhu absolut o K Ea : Energi aktifasi kkalgmol. o K R : Tetapan gas 1.987 kalgmol. o K Ao : Faktor frekuensi 30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. PRODUKSI ENZIM