Metodologi Penelitian sebelum digunakan.
II. Metodologi Penelitian sebelum digunakan.
2.1 Bahan kimia,
peralatan
dan
Medium yang paling cocok akan digunakan Bahan-bahan yang digunakan adalah n-
instrumentasi
untuk pertumbuhan kultur mikroalga N. heksana, metanol, Medium Bold’s Basal
oculata selanjutnya.
(BBM), Medium Nutrient Agar (NA), Medium Potato Dextrose Agar (PDA),
2.2.3 Pembuatan
kurva pengaruh
kloroform, H 2 SO 4 pekat, air laut steril, kertas
medium terhadap pertumbuhan
saring Whatman
streptomycin sulphate (kontrol positif bakteri), Mikroalga N. oculata ditumbuhkan pada ketoconazole (kontrol positif jamur), bakteri
medium yang berbeda yaitu medium BBM gram-negatif Escherichia coli (E. coli), bakteri
dan medium BBM air laut dalam botol gelas gram-positif
100 mL dengan volume kultur 88 mL. aureus) , dan jamur Candida albicans (C.
Staphylococcus aureus
(S.
Cahaya diperoleh dari cahaya matahari. albicans) . Suhu selama kultivasi adalah suhu ruangan
C. Udara diaerasikan ke medium dari Spektrofotometer
± 28 o
mulut botol gelas menggunakan pompa lampu neon spiral 24 watt (Visalux),
UV-Vis
Genesys 20,
mendapatkan kurva sentrifus, petridish, jarum ose, autoclave,
udara.
Untuk
mikroalga dilakukan laminar flow, cotton bud , mikroskop cahaya,
pertumbuhan
absorban menggunakan ultrasonikator Bandelin Sonorex Digitec,
pengukuran
spektrofotometer UV-Vis pada panjang corong pisah, pipet mikro, jangka sorong
gelombang 540 nm 10 setiap harinya hingga Kromatografi Gas-Spektrum Massa (GC-
nilai absorban mengalami penurunan. MS), aplikasi Luxmeter, serta peralatan gelas laboratorium.
2.2.4 Pembuatan
kurva pengaruh
sumber
cahaya terhadap
2.2 Prosedur penelitian pertumbuhan mikroalga
Mikroalga N. oculata ditumbuhkan pada Mikroalga yang diperoleh dari stok di
2.2.1 Pengamatan sel mikroalga
medium BBM dalam botol gelas 100 mL laboratorium
dengan volume kultur 88 mL, dan cahaya mengambil kultur mikroalga N. oculata
diidentifikasi
dengan
dari lampu neon spiral dengan intensitas sebanyak
3000 lux dan fotoperiode 12 jam terang dan kemudian diteteskan di kaca preparat dan
12 jam gelap. 5 Suhu selama kultivasi adalah kemudian
C berasal dari lampu. Untuk menggunakan mikroskop cahaya.
kurva pertumbuhan mikroalga dilakukan pengukuran absorban
2.2.2 Pembuatan medium BBM dan
menggunakan spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 540 nm setiap Medium BBM dan medium BBM yang
BBM modifikasi
harinya hingga nilai absorban mengalami dimodifikasi menggunakan air laut steril.
penurunan.
Stok larutan medium BBM dibuat dengan memipet
2.2.5 Kultur mikroalga
sebanyak 10 mL dan mikronutrien (7-10)
2.2.5.1 Pemeliharaan kultur murni N. sebanyak 1 mL diencerkan dengan akuades
oculata
oculata diperoleh dari diautoklaf dan medium didinginkan hingga
sampai volume 1 L kemudian medium
Mikroalga
N.
Biokimia Unand dan suhu ruang sebelum digunakan. Sedangkan
laboratorium
dikultivasi pada medium yang paling cocok stok larutan medium BBM air laut dibuat
dengan menambahkan medium pada kultur dengan
dengan perbandingan tertentu. Cahaya sebanyak 10 mL dan mikronutrien (7-10)
selama kultivasi diperoleh dari cahaya selama kultivasi diperoleh dari cahaya
(1:6 b/b) dengan 2 tetes katalis H 2 SO 4 p.a, medium
C. Udara diaerasikan ke
dipanaskan dalam oven selama 30 menit menggunakan pompa udara. Setiap kultur
dari mulut
botol
gelas
C. Setelah selesai 4 mL terlihat sangat rapat dilakukan kembali
pada suhu 80 o
akuades dan 4 mL kloroform ditambahkan, penambahan medium secara bertahap.
campuran disentrifugasi. Lapisan kloroform Metode ini dilakukan untuk memelihara
diambil kemudian diuapkan pada suhu kultur murni N. oculata agar tidak mati.
ruangan sampai kering. 12
2.2.5.2 Estimasi pertumbuhan
dan
2.2.9 Uji aktifitas antimikroba
biomassa kering Uji aktifitas antimikroba dari asam lemak Berat kering biomasa N. oculata pada akhir
dan FAME mikroalga N. oculata secara in fasa
vitro dilakukan menggunakan metoda difusi pertumbuhan ditentukan dengan kurva
cakram. 4 dan 13
kalibrasi standar yang ditentukan dari persamaan regresi antara absorban dan
2.2.9.1 Uji aktifitas antimikroba asam berat kering. Enam kultur (10 mL)
lemak
mikroalga dibuat dengan menambahkan Medium NA dan PDA steril dituangkan medium dengan perbandingan 0:10, 2:8, 4:6,
kedalam cawan petri yang berbeda dan 6:4, 8:2 10:0 (medium : kultur). Masing-
didiamkan pada suhu kamar hingga masing kultur diukur serapannya pada 540
memadat. Suspensi bakteri dituangkan nm kemudian dilakukan sentrifugasi untuk
kedalam cawan petri berisi medium NA, mendapatkan biomassa, biomassa yang
suspensi jamur dituangkan kedalam cawan diperoleh
petri berisi medium PDA diratakan dengan beratnya konstan, berat kering biomassa
dikeringanginkan
hingga
bantuan cotton bud sampai membasahi ditentukan secara gravimetri. Dibuat kurva
semua permukaan media. Cakram steril kalibrasi standar dengan absorban sebagai x
(kertas saring Whatman No. 1) dicelupkan dan berat kering sebagai y.
kedalam ekstrak lipid yang telah dilarutkan dengan
n-heksana
untuk konsentrasi
masing –masing 100, 200, dan 300 mg/L, Mikroalga pada fasa akhir eksponensial
2.2.6 Pemanenan mikroalga
diletakkan diatas lapisan agar yang telah dipanen dengan sentrifugasi 3500 rpm
memadat. Kontrol positif digunakan untuk selama
bakteri adalah streptomycin sulphate, untuk dikeringkan pada suhu ruangan dan
ketoconazole dengan disimpan dalam lemari pendingin -20 °C.
jamur
adalah
konsentrasi 10 mg/L dan kontrol negatif adalah n-heksana. Cawan petri diinkubasi
C selama 24 jam, zona Ekstraksi lipid mikroalga dilakukan dengan
2.2.7 Ekstraksi lipid
pada suhu 37 o
hambat yang terbentuk disekitar kertas cara sonikasi. Mikroalga kering (100 mg)
cakram diukur diameternya. dicampurkan dengan n-heksana 10 mL, kemudian disonikasi selama 30 menit pada
2.2.9.2 Uji aktifitas antimikroba FAME sonikator dengan resonansi 35 kHz. Filtrat
Medium NA dan PDA steril dituangkan dipisahkan dan pelet yang didapatkan
kedalam cawan petri yang berbeda dan kemudian ditambahkan n-heksana kembali
didiamkan pada suhu kamar hingga untuk dilakukan proses ekstraksi, proses
memadat. Suspensi bakteri dituangkan diulang hingga ekstraksi lipid selesai
kedalam cawan petri berisi medium NA, dilakukan.
suspensi jamur dituangkan kedalam cawan dibiarkan
pada suhu
kamar
untuk
petri berisi medium PDA, diratakan dengan menguapkan pelarut. 11 bantuan cotton bud sampai membasahi semua permukaan media. Cakram steril
2.2.8 Transesterifikasi lipid
(kertas saring Whatman No. 1) dicelupkan kedalam FAME yang telah dilarutkan (kertas saring Whatman No. 1) dicelupkan kedalam FAME yang telah dilarutkan
sehingga mikroalga N. oculata akan lebih masing –masing 100, 200, dan 300 mg/L
untuk
konsentrasi
baik tumbuh karena telah beradaptasi diletakkan diatas lapisan agar yang telah
dengan medium BBM.
memadat. Kontrol positif digunakan untuk
bakteri adalah streptomycin sulphate, untuk
jamur adalah ketoconazole dan kontrol
m 0,6
0 4 n 0,5
negatif adalah n-heksana. Cawan petri
diinkubasi pada suhu 37 o
C selama 24 jam,
zona hambat yang terbentuk disekitar kertas
cakram diukur diameternya.
2.2.10 Analisis GC-MS
tic p
Produk hasil transesterifikasi
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 dianalisis menggunakan GC-MS dengan
(FAME)
Waktu (hari) eksternal standar metil nonadekanoat.
11 dan 12
Medium BBM
Medium BBM + Air Laut