Metodologi Penelitian sebelum digunakan.

II. Metodologi Penelitian sebelum digunakan.

2.1 Bahan kimia,

peralatan

dan

Medium yang paling cocok akan digunakan Bahan-bahan yang digunakan adalah n-

instrumentasi

untuk pertumbuhan kultur mikroalga N. heksana, metanol, Medium Bold’s Basal

oculata selanjutnya.

(BBM), Medium Nutrient Agar (NA), Medium Potato Dextrose Agar (PDA),

2.2.3 Pembuatan

kurva pengaruh

kloroform, H 2 SO 4 pekat, air laut steril, kertas

medium terhadap pertumbuhan

saring Whatman

streptomycin sulphate (kontrol positif bakteri), Mikroalga N. oculata ditumbuhkan pada ketoconazole (kontrol positif jamur), bakteri

medium yang berbeda yaitu medium BBM gram-negatif Escherichia coli (E. coli), bakteri

dan medium BBM air laut dalam botol gelas gram-positif

100 mL dengan volume kultur 88 mL. aureus) , dan jamur Candida albicans (C.

Staphylococcus aureus

(S.

Cahaya diperoleh dari cahaya matahari. albicans) . Suhu selama kultivasi adalah suhu ruangan

C. Udara diaerasikan ke medium dari Spektrofotometer

± 28 o

mulut botol gelas menggunakan pompa lampu neon spiral 24 watt (Visalux),

UV-Vis

Genesys 20,

mendapatkan kurva sentrifus, petridish, jarum ose, autoclave,

udara.

Untuk

mikroalga dilakukan laminar flow, cotton bud , mikroskop cahaya,

pertumbuhan

absorban menggunakan ultrasonikator Bandelin Sonorex Digitec,

pengukuran

spektrofotometer UV-Vis pada panjang corong pisah, pipet mikro, jangka sorong

gelombang 540 nm 10 setiap harinya hingga Kromatografi Gas-Spektrum Massa (GC-

nilai absorban mengalami penurunan. MS), aplikasi Luxmeter, serta peralatan gelas laboratorium.

2.2.4 Pembuatan

kurva pengaruh

sumber

cahaya terhadap

2.2 Prosedur penelitian pertumbuhan mikroalga

Mikroalga N. oculata ditumbuhkan pada Mikroalga yang diperoleh dari stok di

2.2.1 Pengamatan sel mikroalga

medium BBM dalam botol gelas 100 mL laboratorium

dengan volume kultur 88 mL, dan cahaya mengambil kultur mikroalga N. oculata

diidentifikasi

dengan

dari lampu neon spiral dengan intensitas sebanyak

3000 lux dan fotoperiode 12 jam terang dan kemudian diteteskan di kaca preparat dan

12 jam gelap. 5 Suhu selama kultivasi adalah kemudian

C berasal dari lampu. Untuk menggunakan mikroskop cahaya.

kurva pertumbuhan mikroalga dilakukan pengukuran absorban

2.2.2 Pembuatan medium BBM dan

menggunakan spektrofotometer UV-Vis

pada panjang gelombang 540 nm setiap Medium BBM dan medium BBM yang

BBM modifikasi

harinya hingga nilai absorban mengalami dimodifikasi menggunakan air laut steril.

penurunan.

Stok larutan medium BBM dibuat dengan memipet

2.2.5 Kultur mikroalga

sebanyak 10 mL dan mikronutrien (7-10)

2.2.5.1 Pemeliharaan kultur murni N. sebanyak 1 mL diencerkan dengan akuades

oculata

oculata diperoleh dari diautoklaf dan medium didinginkan hingga

sampai volume 1 L kemudian medium

Mikroalga

N.

Biokimia Unand dan suhu ruang sebelum digunakan. Sedangkan

laboratorium

dikultivasi pada medium yang paling cocok stok larutan medium BBM air laut dibuat

dengan menambahkan medium pada kultur dengan

dengan perbandingan tertentu. Cahaya sebanyak 10 mL dan mikronutrien (7-10)

selama kultivasi diperoleh dari cahaya selama kultivasi diperoleh dari cahaya

(1:6 b/b) dengan 2 tetes katalis H 2 SO 4 p.a, medium

C. Udara diaerasikan ke

dipanaskan dalam oven selama 30 menit menggunakan pompa udara. Setiap kultur

dari mulut

botol

gelas

C. Setelah selesai 4 mL terlihat sangat rapat dilakukan kembali

pada suhu 80 o

akuades dan 4 mL kloroform ditambahkan, penambahan medium secara bertahap.

campuran disentrifugasi. Lapisan kloroform Metode ini dilakukan untuk memelihara

diambil kemudian diuapkan pada suhu kultur murni N. oculata agar tidak mati.

ruangan sampai kering. 12

2.2.5.2 Estimasi pertumbuhan

dan

2.2.9 Uji aktifitas antimikroba

biomassa kering Uji aktifitas antimikroba dari asam lemak Berat kering biomasa N. oculata pada akhir

dan FAME mikroalga N. oculata secara in fasa

vitro dilakukan menggunakan metoda difusi pertumbuhan ditentukan dengan kurva

cakram. 4 dan 13

kalibrasi standar yang ditentukan dari persamaan regresi antara absorban dan

2.2.9.1 Uji aktifitas antimikroba asam berat kering. Enam kultur (10 mL)

lemak

mikroalga dibuat dengan menambahkan Medium NA dan PDA steril dituangkan medium dengan perbandingan 0:10, 2:8, 4:6,

kedalam cawan petri yang berbeda dan 6:4, 8:2 10:0 (medium : kultur). Masing-

didiamkan pada suhu kamar hingga masing kultur diukur serapannya pada 540

memadat. Suspensi bakteri dituangkan nm kemudian dilakukan sentrifugasi untuk

kedalam cawan petri berisi medium NA, mendapatkan biomassa, biomassa yang

suspensi jamur dituangkan kedalam cawan diperoleh

petri berisi medium PDA diratakan dengan beratnya konstan, berat kering biomassa

dikeringanginkan

hingga

bantuan cotton bud sampai membasahi ditentukan secara gravimetri. Dibuat kurva

semua permukaan media. Cakram steril kalibrasi standar dengan absorban sebagai x

(kertas saring Whatman No. 1) dicelupkan dan berat kering sebagai y.

kedalam ekstrak lipid yang telah dilarutkan dengan

n-heksana

untuk konsentrasi

masing –masing 100, 200, dan 300 mg/L, Mikroalga pada fasa akhir eksponensial

2.2.6 Pemanenan mikroalga

diletakkan diatas lapisan agar yang telah dipanen dengan sentrifugasi 3500 rpm

memadat. Kontrol positif digunakan untuk selama

bakteri adalah streptomycin sulphate, untuk dikeringkan pada suhu ruangan dan

ketoconazole dengan disimpan dalam lemari pendingin -20 °C.

jamur

adalah

konsentrasi 10 mg/L dan kontrol negatif adalah n-heksana. Cawan petri diinkubasi

C selama 24 jam, zona Ekstraksi lipid mikroalga dilakukan dengan

2.2.7 Ekstraksi lipid

pada suhu 37 o

hambat yang terbentuk disekitar kertas cara sonikasi. Mikroalga kering (100 mg)

cakram diukur diameternya. dicampurkan dengan n-heksana 10 mL, kemudian disonikasi selama 30 menit pada

2.2.9.2 Uji aktifitas antimikroba FAME sonikator dengan resonansi 35 kHz. Filtrat

Medium NA dan PDA steril dituangkan dipisahkan dan pelet yang didapatkan

kedalam cawan petri yang berbeda dan kemudian ditambahkan n-heksana kembali

didiamkan pada suhu kamar hingga untuk dilakukan proses ekstraksi, proses

memadat. Suspensi bakteri dituangkan diulang hingga ekstraksi lipid selesai

kedalam cawan petri berisi medium NA, dilakukan.

suspensi jamur dituangkan kedalam cawan dibiarkan

pada suhu

kamar

untuk

petri berisi medium PDA, diratakan dengan menguapkan pelarut. 11 bantuan cotton bud sampai membasahi semua permukaan media. Cakram steril

2.2.8 Transesterifikasi lipid

(kertas saring Whatman No. 1) dicelupkan kedalam FAME yang telah dilarutkan (kertas saring Whatman No. 1) dicelupkan kedalam FAME yang telah dilarutkan

sehingga mikroalga N. oculata akan lebih masing –masing 100, 200, dan 300 mg/L

untuk

konsentrasi

baik tumbuh karena telah beradaptasi diletakkan diatas lapisan agar yang telah

dengan medium BBM.

memadat. Kontrol positif digunakan untuk

bakteri adalah streptomycin sulphate, untuk

jamur adalah ketoconazole dan kontrol

m 0,6

0 4 n 0,5

negatif adalah n-heksana. Cawan petri

diinkubasi pada suhu 37 o

C selama 24 jam,

zona hambat yang terbentuk disekitar kertas

cakram diukur diameternya.

2.2.10 Analisis GC-MS

tic p

Produk hasil transesterifikasi

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 dianalisis menggunakan GC-MS dengan

(FAME)

Waktu (hari) eksternal standar metil nonadekanoat.

11 dan 12

Medium BBM

Medium BBM + Air Laut