Gambar 15b. Cara pemaparan asap rokok elektrik
3.6.3. Pengamatan
Setelah 15 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Selanjutnya dilakukan pengamatan
sebagai berikut : Pengambilan sekresi cauda epididimis. Untuk mendapatkan sperma di dalam
sekresi cauda epididimis dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad 1983 sebagai berikut: hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya
dibedah. Kemudian organ testis beserta epididimis sebelah kanan diambil dan diletakkan ke dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9 . Di bawah mikroskop
bedah dengan pembesaran 400 kali, cauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens.
Selanjutnya cauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9 , kemudian bagian proximal cauda dipotong sedikit dengan gunting lalu cauda
ditekan dengan perlahan hingga sekresi cairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9 . Suspensi sperma dari cauda epididimis yang telah diperoleh
dapat digunakan untuk pengamatan yang meliputi: motilitas dan jumlah sperma.
Universitas Sumatera Utara
Pengamatan motilitas sperma. Suspensi spermatozoa yang diperoleh biarkan terlebih dahulu selama 5 menit pada suhu kamar selanjutnya teteskan suspensi ini
pada kamar hitung Improved Neubauer dan diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa objektif 40 kali. Periksa 4 – 6 lapangan pandang untuk
mendapat 100 spermatozoa secara berurutan yang kemudian diklasifikasi sehingga menghasilkan persentase setiap kategori motilitas.
Pengamatan jumlah sperma. Suspensi sperma yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan. Selanjutnya diambil sebanyak 10 µl sampel dan dimasukkan
ke dalam kotak-kotak hemositometer Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca penutup. Di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, hemositometer
diletakkan dan dihitung jumlah sperma pada kotakbidang A,B,C,D, dan E. Hasil perhitungan jumlah sperma kemudian dimasukkan ke dalam rumus penentuan jumlah
spermaml suspensi sekresi cauda epididimis sebagai berikut:
Jumlah sperma = N 2 x 10
5
sperma ml suspensi
dimana, N = jumlah sperma yang dihitung pada kotak A,B,C,D,dan E.
Gambar 16. Kamar hitung Improved Neubauer Zaneveld dan Fulgham, 1986
Universitas Sumatera Utara
Pemeriksaan kadar MDA. Pemeriksaan kadar MDA testis mencit dilakukan
pada hari ke-16 setelah perlakuan pada semua kelompok. Testis dihomogenkan dalam 5 ml larutan buffer phosphate pH 7,2. Metode pemeriksaan MDA yang
telah dimodifikasi sebagai berikut Hsieh et all., 2006 : a
Reagensia : 1
2-Thiobarbituric acid Merck; Cat. No. 1.08180.0025 2
1,1,3,3-Tetramethoxypropane 99 Sigma; Cat. No. 108383 500 µM 3
Acetic acid glacial 4
Sodium hydroxide NaOH 5
Aquadest b
Persiapan reagensia : 1. TBABuffer Reagent
TBABuffer Reagent terdiri dari : 0,67 g 2-thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya 0,5 g sodium hydroxide dan 100 mL asam
asetat glacial. 2. Standard MDA
Sebanyak 250 µL 1,1,3,3-tetramethoxypropane Malondialdehyde bis 500 µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest untuk memperoleh larutan stok MDA 125
µM. Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan dibuat 8 seri standar yang dapat dilihat pada tabel berikut ini :
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3. Persiapan Standar MDA Spektrofotometer Nomor
standard Konsentrasi MDA
µM Volume MDA
standard µL Volume pelarut
µL 8 50
400 600
7 25 200
800 6 10
80 920
5 5 40
960 4 2,5
20 980
3 1,25 10
990 2 0,625
5 995
1 0 1000
c Prosedur uji :
1 Sebanyak 500 µl sampel atau standar MDA dimasukkan dalam tabung
ependorf yang masing-masing telah diberi label. 2
Ditambahkan 0,5 ml aquadest pada masing-masing tabung. 3
Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBA Buffer Reagent. 4
Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 95
C selama 60 menit. 5
Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan
7000 rpm selama 10 menit. 6
Supernatan diambil untuk selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 534 nm.
3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku rata-
rata ± SD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Data terdistribusi
Universitas Sumatera Utara
normal dan homogen diuji dengan ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan dengan Post Hoc analisis Bonferroni taraf 5 untuk melihat
perbedaan antar kelompok kontrol dan masing-masing perlakuan.
Semua analisis data dilakukan dengan menggunakan SPSS software. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada taraf 5 yang dianggap berbeda
nyata signifikan.
3.8. Jadwal Penelitian
Kategori