Gambar 13. Vortex mixer
Gambar 14. Water bath
3.5. Disain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang didisain mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Penelitian ini terdiri atas 3 kelompok
perlakuan, yaitu: a
Kelompok I P0 = terdiri dari 10 ekor mencit jantan dewasa yang tidak diberi perlakuan kelompok kontrol.
b Kelompok II P1 = terdiri dari 10 ekor mencit jantan dewasa yang diberi
paparan asap rokok elektrik A setiap hari selama 15 hari. c
Kelompok III P2 = terdiri dari 10 ekor mencit jantan dewasa yang diberi paparan asap rokok elektrik B setiap hari selama 15 hari.
Mencit ditempatkan ke dalam kelompok secara random.
Universitas Sumatera Utara
P2 →→→→→→→ Paparan asap rokok elektrik B →→→→→→→→→
P1 →→→→→→→ Paparan asap rokok elektrik A →→→→→→→→→
P0 →→→→→→→→→→→→ Kontrol →→→→→→→→→→→→
0 hari 15 hari
3.6. Pelaksanaan Penelitian 3.6.1. Pemeliharaan hewan coba
Pemeliharaan terhadap hewan coba dilakukan di kandang hewan
Laboratorium Struktur Hewan Departemen Biologi FMIPA Universitas Sumatera Utara. Perlakuan terhadap hewan coba berpedoman pada prinsip-prinsip penelitian
kesehatan yang menggunakan hewan menurut etis, prosedur dan standar yang dibuktikan dengan Ethical Clearance dari Komite Etik Penelitian Hewan Fakultas
MIPA Universitas Sumatera Utara. Mencit diaklimatisasi selama 1 minggu dan ditempatkan di dalam kandang
yang terbuat dari bahan plastik ukuran 40 x 30 x 13 cm yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan
diganti setiap 3 hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul
06.00, sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan pelet komersial dan minum air PAM disuplai setiap hari secara
berlebih.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2. Perlakuan hewan coba - Pemaparan dengan asap rokok elektrik diberikan ke dalam kandang perlakuan
yang diisi dengan 10 ekor mencit, dilakukan 1 kali sehari dalam 24 jam selama 15 hari dan dimulai pada jam yang sama setiap harinya yaitu pukul 10.00 WIB.
- Saat rokok elektrik dihisap, bagian Discofix-3 tree way yang terhubung dengan rokok elektrik bagian hisap diatur pada posisi on dan saluran keluaran asap
menuju kandang perlakuan diatur pada posisi off sehingga asap rokok elektrik tertarik masuk ke dalam spuit naso gastric tube.
- Asap yang terkumpul di dalam spuit naso gastric tube lalu dipompakan keluar menuju kandang perlakuan dengan mengatur ulang Discofix-3 tree way yaitu
memposisikan bagian hisap asap rokok elektrik pada posisi off dan bagian saluran keluaran asap rokok elektrik pada posisi on sehingga asap rokok mnegalir masuk
ke dalam kandang perlakuan pada saat dipompakan. - Lamanya waktu pemaparan asap rokok elektrik adalah lebih kurang 30 menit
dan dilakukan sekitar 55 kali tarikan spuit naso gastric tube dalam setiap kali pemaparan asap rokok elektrik. Teknik dan cara pemaparan asap rokok elektrik
diperlihatkan pada gambar berikut ini :
Gambar 15a. Cara pemaparan asap rokok elektrik
Universitas Sumatera Utara
Gambar 15b. Cara pemaparan asap rokok elektrik
3.6.3. Pengamatan
Setelah 15 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Selanjutnya dilakukan pengamatan
sebagai berikut : Pengambilan sekresi cauda epididimis. Untuk mendapatkan sperma di dalam
sekresi cauda epididimis dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad 1983 sebagai berikut: hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya
dibedah. Kemudian organ testis beserta epididimis sebelah kanan diambil dan diletakkan ke dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9 . Di bawah mikroskop
bedah dengan pembesaran 400 kali, cauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens.
Selanjutnya cauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9 , kemudian bagian proximal cauda dipotong sedikit dengan gunting lalu cauda
ditekan dengan perlahan hingga sekresi cairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9 . Suspensi sperma dari cauda epididimis yang telah diperoleh
dapat digunakan untuk pengamatan yang meliputi: motilitas dan jumlah sperma.
Universitas Sumatera Utara
Pengamatan motilitas sperma. Suspensi spermatozoa yang diperoleh biarkan terlebih dahulu selama 5 menit pada suhu kamar selanjutnya teteskan suspensi ini
pada kamar hitung Improved Neubauer dan diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa objektif 40 kali. Periksa 4 – 6 lapangan pandang untuk
mendapat 100 spermatozoa secara berurutan yang kemudian diklasifikasi sehingga menghasilkan persentase setiap kategori motilitas.
Pengamatan jumlah sperma. Suspensi sperma yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan. Selanjutnya diambil sebanyak 10 µl sampel dan dimasukkan
ke dalam kotak-kotak hemositometer Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca penutup. Di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, hemositometer
diletakkan dan dihitung jumlah sperma pada kotakbidang A,B,C,D, dan E. Hasil perhitungan jumlah sperma kemudian dimasukkan ke dalam rumus penentuan jumlah
spermaml suspensi sekresi cauda epididimis sebagai berikut:
Jumlah sperma = N 2 x 10
5
sperma ml suspensi
dimana, N = jumlah sperma yang dihitung pada kotak A,B,C,D,dan E.
Gambar 16. Kamar hitung Improved Neubauer Zaneveld dan Fulgham, 1986
Universitas Sumatera Utara
Pemeriksaan kadar MDA. Pemeriksaan kadar MDA testis mencit dilakukan
pada hari ke-16 setelah perlakuan pada semua kelompok. Testis dihomogenkan dalam 5 ml larutan buffer phosphate pH 7,2. Metode pemeriksaan MDA yang
telah dimodifikasi sebagai berikut Hsieh et all., 2006 : a
Reagensia : 1
2-Thiobarbituric acid Merck; Cat. No. 1.08180.0025 2
1,1,3,3-Tetramethoxypropane 99 Sigma; Cat. No. 108383 500 µM 3
Acetic acid glacial 4
Sodium hydroxide NaOH 5
Aquadest b
Persiapan reagensia : 1. TBABuffer Reagent
TBABuffer Reagent terdiri dari : 0,67 g 2-thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya 0,5 g sodium hydroxide dan 100 mL asam
asetat glacial. 2. Standard MDA
Sebanyak 250 µL 1,1,3,3-tetramethoxypropane Malondialdehyde bis 500 µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest untuk memperoleh larutan stok MDA 125
µM. Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan dibuat 8 seri standar yang dapat dilihat pada tabel berikut ini :
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3. Persiapan Standar MDA Spektrofotometer Nomor
standard Konsentrasi MDA
µM Volume MDA
standard µL Volume pelarut
µL 8 50
400 600
7 25 200
800 6 10
80 920
5 5 40
960 4 2,5
20 980
3 1,25 10
990 2 0,625
5 995
1 0 1000
c Prosedur uji :
1 Sebanyak 500 µl sampel atau standar MDA dimasukkan dalam tabung
ependorf yang masing-masing telah diberi label. 2
Ditambahkan 0,5 ml aquadest pada masing-masing tabung. 3
Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBA Buffer Reagent. 4
Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 95
C selama 60 menit. 5
Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan
7000 rpm selama 10 menit. 6
Supernatan diambil untuk selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 534 nm.
3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku rata-
rata ± SD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Data terdistribusi
Universitas Sumatera Utara
normal dan homogen diuji dengan ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan dengan Post Hoc analisis Bonferroni taraf 5 untuk melihat
perbedaan antar kelompok kontrol dan masing-masing perlakuan.
Semua analisis data dilakukan dengan menggunakan SPSS software. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada taraf 5 yang dianggap berbeda
nyata signifikan.
3.8. Jadwal Penelitian
Keseluruhan kegiatan penelitian dari persiapan sampai pada penulisan hasil penelitian adalah lebih kurang 7 minggu. Urutan kegiatan dan jadwal pelaksanaan
secara lengkap dapat dilihat pada tabel berikut ini: Tabel 4. Jadwal Penelitian
Minggu No.
Kegiatan 1 2 3 4 5 6 7
1 Persiapan
√ √
2 Pelaksanaan
√ √ √
3 Analisa Data
√
4 Penulisan Hasil
√
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian 4.1.1. Motilitas sperma mencit
Setelah dilakukan penilaian terhadap motilitas sperma mencit pada tiap kelompok maka didapatkan hasil seperti yang terlihat pada tabel 5 di bawah ini :
Tabel 5. Rata-Rata Persentase Motilitas Sperma
Motilitas sperma Kelompok
perlakuan Kategori a
Kategori b Kategori c
Kategori d Kategori a+b
P0 20,88 ±
4,32 22,13 ±
5,44 15,50
± 12,93
41,50 ±
14,86 43,01±0,88
a
P1 2,38 ±
2,00 3,50 ±
2,88 14,50 ±
7,52 79,63 ±
10,39 5,88±0,79
b
P2 3,50 ±
5,53 1,38 ±
2,20 12,38 ±
9,50 82,75 ±
9,08 4,88±1,50
b
Nilai dalam X ±SD X , rata-rata; SD, standar deviasi; tabel pada kolom kategori a+b untuk perlakuan yang berbeda diikuti oleh huruf kecil yang sama berbeda
tidak nyata pada taraf uji 5 ; P0, kontrol tidak diberi perlakuan; P1, paparan asap rokok elektrik A selama 15 hari; P2, paparan asap rokok elektrik B selama 15
hari; kategori a, jika sperma bergerak cepat dan lurus ke depan gerak maju sangat baik; kategori b, jika geraknya lambat atau sulit maju lurus atau bergerak tidak
lurus gerak lemah; kategori c, jika tidak bergerak maju; kategori d, jika sperma tidak bergerak.
Dari tabel 5 di atas terlihat bahwa persentase motilitas sperma mencit kelompok P2 yang mendapat paparan asap rokok elektrik B 4,88±1,50 lebih
sedikit dibandingkan motilitas sperma mencit kelompok P1 yang mendapat paparan asap rokok elektrik A 5,88±0,79 dan kelompok P0 yang merupakan
kelompok kontrol 43,01±0,88. Hasil uji statistik menunjukkan bahwa motilitas sperma mencit kelompok P2 berbeda nyata dibandingkan dengan motilitas
sperma mencit kelompok P0 dan berbeda tidak nyata dibandingkan
Universitas Sumatera Utara
Kategori