BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Analisis secara kromatografi yang berhasil baik berkaitan dengan mengkompromikan daya pisah kromatografi, beban cuplikan, dan waktu analisis
atau kecepatan seperti digambarkan dalam segitiga kromatografiwan pada gambar 1 di bawah ini.
Daya Pisah
Kecepatan Kapasitas
Gambar 1
Hubungan antara daya pisah, kecepatan dan kapasitas Gambar tersebut menunjukkan bahwa, dalam batas tertentu, mungkin saja kita
mengubah kondisi pemisahan untuk memperbaiki salah satu dari ketiga hal itu dengan mengorbankan hal lain. pengalaman menunjukkan bahwa pemahaman
teori kromatografi secara kualitatif akan membantu kromatografiwan dalam mengoptimumkan pemisahan secara cepat. Walaupun ada cara pengoptimuman
yang canggih, ternyata kondisi pemisahan yang optimum harus dicari dengan hanya mengubah-ubah satu parameter pada suatu saat Johnson, 1991.
2.1 Deksklorfeniramin maleat
Rumus struktur :
Universitas Sumatera Utara
Gambar 1. struktur Deksklorfeniramin maleat
Nama Kimia : + -2-[P-kloro-
α-[2-dimetilaminoetil]benzil]piridina maleat 1:1 Rumus Molekul : C
16
H
19
ClN
2
.C
4
H
4
O
4
Berat Molekul : 390,87 Depkes RI, 1995
Pemerian : Serbuk hablur, putih ; tidak berbau
Kelarutan : Mudah larut dalam air, larut dalam etanol dan dalam
kloroform, sukar larut dalam benzena dan dalam eter. Depkes RI, 1995.
2.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada
dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam
kromatografi cair dan jiga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair.
Universitas Sumatera Utara
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi
dibedakan menjadi : a Kromatografi adsorbsi
b Kromatografi partisi c Kromatografi pasangan ion
d Kromatografi penukar ion e Kromatografi eksklusi ukuran, dan
f Kromatografi afinitas Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas :
a Kromatografi kertas b Kromatografi lapis tipis
c Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT, dan d Kromatografi gas Rohman, 2007.
2.2.1 Penggunaan Kromatografi
1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu dalam cuplikan
2. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran
3. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
2.2.2 Profil puncak dan pelebaran puncak
Universitas Sumatera Utara
Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah
aliran fase gerak. Profil dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan – lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena solut
– solut melanjutkan migrasinya ke fase diam Rohman, 2007.
2.2.3 Puncak asimetris
Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi solut D konstan selama dikisaran konsentrasi keseluruhan puncak,
sebagaimana ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linear yang merupakan plot konsentrasi solut dalam fase diam Cs terhadap konsentrasi solut dalam fase
gerakCm. Meskipun demikian, kurva isot erm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris yakni membentuk puncak yang berekor tailing dan adanya
puncak pendahulu fronting jika ada perubahan rasio distribusi solut yang lebih besar.
Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak
berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier.
1. Metode tinggi puncak
Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke
puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara awal dan akhir puncak.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.
Pengukuran tinggi puncak Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak
linier dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan pada puncak yang mengalami penyimpangan asimetris atau jika kolom
mengalami kelebihan muatan. 2.
Metode luas puncak Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu
teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi W
12
. Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau yang mempunyai bentuk
serupa Johnson, 1991. Saat ini integrator elektronik telah banyak digunakan untuk mengukur luas
puncak pada kromatografi cair kinerja tinggi dan pada kromatografi gas. Integrator digital mengukur luas puncak dan mengubahnya dalam bentuk angka
Rohman, 2007. Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan
konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi
Universitas Sumatera Utara
pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif Ditjen POM, 1995.
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara
kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Ditjen POM, 1995.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap
nonvolatil. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa- senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-
protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.
Kelebihan KCKT antara lain:
− Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran − Resolusinya baik
− Mudah melaksanakannya − Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
Universitas Sumatera Utara
− Dapat dihindari terjadinya dekomposisikerusakan bahan yang dianalisis − Dapat digunakan bermacam-macam detektor
− Kolom dapat digunakan kembali − Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik
− Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif − Waktu analisis umumnya singkat
− Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar − Ideal untuk molekul besar dan ion.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa MS. Keterbatasan lainnya
adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh Munson, 1991.
2.3.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007.
2.3.2 Komponen KCKT
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.
Bagan alat KCKT
2.3.3 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat meampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis Rohman, 2007.
2.3.4 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
pompa
injektor kolom
oven detektor
Wadah solven
Data processor
Universitas Sumatera Utara
kecepatan alir 3 mlmenit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL menit Rohman, 2007.
2.3.5 Injektor
Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic injector autosampler
. Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling sederhana Meyer, 2004.
Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom.
Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom on column injection atau digunakan katup injeksi Adnan, 1997.
Katup putaran loop valve ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 8, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi
LOAD , sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan atmosfir. Bila
katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.
Gambar 8.
Tipe injektor katup putaran
Universitas Sumatera Utara
Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip,
hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis Meyer, 2004.
2.3.6 Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok : a. Kolom analitik : garis tengah dalam 2 – 6 nm. Panjang bergantung pada
jenis kemasan,untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50 – 100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, biasanya 10 – 30 cm;
b. Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 – 100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama
untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan Johnson, 1991.
2.3.7 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
Universitas Sumatera Utara
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor
spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.
2.3.8 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram
Guna kromatogram:
1. Kualitatif Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama
dapat digunakan untuk identifikasi. 2. Kuantitatif
Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom kapasitas ‘k’, selektifitas ‘
α’, jumlah pelat teoritis ‘N’, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’.
2.3.9 Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson, 1991.
Universitas Sumatera Utara
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus: • Murni; tidak ada pencemarkontaminan
• Tidak bereaksi dengan pengemas • Sesuai dengan detektor
• Melarutkan cuplikan • Mempunyai viskositas rendah
• Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan • Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara degassing yang ada harus dihilangkan dari pelarut,
karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan Johnson, 1991.
Elusi Gradien dan Isokratik
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik komposisi fase gerak tetap selama elusi atau dengan cara bergradien komposisi fase gerak berubah – ubah
selama elusi. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas
Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas :
a. Kromatografi Fase Normal Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika
gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan. b. Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilan ODS atau C18 dan oktilsilan C8. Sedangkan fase
geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril Mulja dan Suharman, 1995.
2.4 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya WHO, 1992.
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia USP dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi
untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada
validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran Ruggedness dan ketahanan Robutness.
Universitas Sumatera Utara
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi RSD dari sejumlah sampel yang
berbeda secara signifikan secara statistik. Batas deteksi limit of detection, LOD didefinisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi. Batas kuantitasi limit of quantitation, LOQ didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil- hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang diberikan Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan November sampai Januari 2011.
3.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu unit alat KCKT Shimadzu yang terdiri dari Vacum degasser, pompa, detektor UVVis, printer,
wadah fase gerak, penyuntik mikroliter 100 µl, Kolom agilent TC-18, neraca analitik mettler Toledo, sonifikator Branson 1510, Pompa vakum Gast DOA -
membran filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose nitrat membran filter 0,45 µm.
3.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu Kalium Dihidrogen Fosfat 0,05 M, Metanol HPLC solvent Merck, Deksklorfeniramin maleat BPFI
Badan POM RI, Deksklorfeniramin maleat baku pabrik PT Phapros, tablet Proxona PT Harsen, tablet Omegtamine PT Mutifa, tablet Pritacort Molex
Ayus, tablet Dextamine PT Phapros, Aquabidestilata PT Ikapharmindo Putramas
3.4 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel
dianggap homogen. Sampel yang digunakan adalah tablet Proxona PT Harsen,
Universitas Sumatera Utara
Kategori