17
Keterangan: = standar deviasi
= kadar reserpasi tiap ulangan = rata-rata kadar reserpin
= jumlah ulangan
3.4. Prosedur Analisis Kolesterol
Prosedur analisis yang dilakukan diawali dengan melakukan persiapan larutan standar kolesterol, persiapan sampel pada matriks telur dan analisis menggunakan HPLC-ELSD.
3.4.1. Persiapan larutan standar kolesterol:
Larutkan 50 mg standar kolesterol powder dalam 50 mL fase gerak heksan:isopropanol = 90:10 dan larutan 150 mg standar kolesterol powder dalam 50 mL fase gerak. Larutan standar stok ini
mempunyai konsentrasi 1000 µgmL dan 15000 µgmL. Dilanjutkan dengan pengenceran larutan stok untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 10 µgmL, 25 µgmL, 50 µgmL, 100 µgmL, 150
µgmL, 250 µgmL, 300 µgmL, 500 µgmL, 750 µgmL, 1500 µgmL, 3000 µgmL, dan 7500 µgmL.
3.4.2. Persiapan sampel pada matriks telur AOAC 976.26.:
Timbang sekitar 3 g sampel telur yang telah di homogenkan kedalam tabung reaksi bertutup, tambahkan 10 mL larutan HCl 4:1 lalu vortex hingga tercampur. Untuk sampel yang diberi
perlakuan spiking, sebelum penambahan HCl sampel diberi tambahan kolesterol standar sebanyak 1 mL untuk setiap konsentrasi. Dilanjutkan dengan penghembusan dengan N
2
selama 30 detik lalu tutup dengan segera untuk menghindari oksidasi kolesterol. Kemudian panaskan pada waterbath mendidih
selama 30 menit, sambil dikocok setiap 5 menit. Dinginkan tabung reaksi tersebut menggunakan air mengalir. Pindahkan isi tabung ke dalam labu pemisah 250 mL, bilas tabung reaksi tersebut dengan
2 x 10 mL air bebas ion, lalu gabungkan air bilasan tersebut ke dalam labu pemisah. Cuci dengan heksan 3 x 10 mL sambil dikocok. Ambil fraksi heksan lalu uapkan fraksi heksan dengan gas N
2
. Setelah kering, saponifikasi dengan 10 mL metanolik KOH 2 dengan pemanasan 80 ºC, 30 menit.
Kemudian ekstrak dengan heksan 3 x 10 mL dalam labu pemisah dan saring dengan menggunakan kertas saring yang diberi tambahan Na
2
SO
4
anhidrous. Uapkan fraksi heksan dengan gas N
2
. Setelah kering, larutkan dengan fase gerak pada volume tertentu 1,0 mL. Kemudian larutan tersebut
diencerkan sebanyak 10 kali tingkat pengenceran. Larutan sampel ini siap diinjeksikan ke HPLC.
18
3.4.3. Pengukuran dengan HPLC-ELSD
Analisis dengan HPLC-ELSD kondisi isokratik menggunakan: Fase gerak
: Heksan: 2-propanol 90:10 Kolom
: silica 25 cm x i.d. 4,6 cm Laju alir
: 2 mLmenit Suhu
: 50 ºC Detektor
: ELSD Sedex 55 dengan tekanan gas N
2
sebesar 2,2 bar, Gain 7.
Volume injeksi : 20 µL
Injeksikan sampel terpisah dengan injeksi standar dengan menggunakan kondisi HPLC diatas, kemudian area respon dicatat. Buat kurva standar hubungan linier antara area dengan konsentrasi
kolesterol standar. Area dari sampel dihubungkan dengan kurva standar untuk memperoleh konsentrasi kolesterol standar dari kurva µgmL. Lakukan perhitungan konsentrasi kolesterol dalam
sampel dengan rumus:
Keterangan: Fp
= faktor pengenceran dari larutan sampel akhir apabila dilakukan pengenceran sebelum larutan diinjeksikan ke HPLC.
19
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Metode ekstraksi kolesterol yang dilakukan pada penelitian ini merupakan metode yang tercantum dalam AOAC 976.26. Pertama-tama dengan dilakukan ekstraksi menggunakan asam HCl
4:1, yang kemudian dilakukan tahap saponifikasi menggunakan KOH 2 seperti pada sub bab 3.4.
4.1. Uji Kesesuaian Sistem
Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 9. berikut. Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa luas area yang didapat adalah 50,9489 mV.s dengan RSD sebesar 2,23. Waktu
retensi yang diperoleh adalah rata-rata berkisar 1,52 menit dengan nilai RSD sebesar 0,59. Tabel 9. Hasil uji kesesuaian sistem analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC - ELSD.
Ulangan Konsentrasi Kolesterol
Standar μgmL
Luas Area mV.s Waktu Retensi
menit
1 50
50,1387 1,527
2 50
51,8594 1,520
3 50
52,2730 1,520
4 50
50,0535 1,527
5 50
51,4215 1,540
6 50
51,6683 1,513
7 50
49,2280 1,533
Rata-Rata 50,9489
1,526 SD
1,14 0,01
RSD 2,23
0,59
Waktu retensi yang dihasilkan memiliki sedikit perbedaan untuk setiap ulangan, hal ini dikarenakan alat HPLC yang digunakan belum secara otomatis dapat mendeteksi sempel setelah
diinjeksikan kedalam kolom.
4.2. Uji Spesifisitas
Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara standar kolesterol, sampel telur dan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol. Berikut adalah gambar hasil
injeksi standar kolesterol pada konsentrasi 1014 µgmL Gambar 9.. Diketahui bahwa kolesterol terdeteksi dan memiliki waktu retensi pada menit ke 1,53.
