14
III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, mulai bulan Maret 2011 sampai dengan Agustus 2011. Berlokasi di Laboratorium Jasa Analisis Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas
Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Kampus IPB Darmaga P.O. Box 220, Bogor 16002. Telp. 0251 8629855 Faks. 0251 628855.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah telur ayam broiler Gallus sp. yang diperoleh dari pasar lokal di sekitar Bogor. Pereaksi yang digunakan adalah metanol, KOH, heksan, gas N
2
teknis, gas N
2
HP high purity, HCl, 2–propanol isopropanol, standar kolesterol kemurnian 95 Sigma Chemical Inc, USA, aqua demineralisasi, Na
2
SO
4
anhidrous, dan kertas saring. Alat yang digunakan pada penelitian ini mencakup neraca analitik Kern Sohn, Jerman,
vortex, waterbath, HPLC LC 6A Shimadzu, Jepang, kolom normal phase LiChrosorb Si 60 10µm 25 cm x i.d. 4,6 cm Merck, Jerman, detektor ELSD Sedex 55 Sedere, Prancis. Alat gelas yang
digunakan seperti tabung reaksi bertutup, labu pemisah, pipet tetes, corong gelas, erlenmeyer, baker glass, sudip, pipet volumetrik, pipet mikro Biohit Proline, pipet Mohr, syringe dan pipet tetes.
3.3. Metode Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan meliputi uji kesesuaian sistem, spesifisitas, pengukuran linieritas metode, limit deteksi instrumen IDL, ketepatan akurasi, ketelitian presisi, method
detection limit MDL, dan intra reprodusibilitas.
3.3.1. Pemilihan dan preparasi sampel
Sampel yang dipergunakan adalah telur ayam broiler Gallus sp.. Sampel ini diperoleh pasar disekitar kota Bogor. Jumlah sampel yang dibeli adalah satu kotak 10 butir. Preparasi sampel
diawali dengan pencampuran 10 butir telur dalam sebuah wadah, kemudian dikocok hingga tercampur rata. Sampel yang telah tercampur rata kemudian di masukkan kedalam 15 kantung plastik kecil dan
disimpan dalam lemari pembeku dengan suhu - 18ºC.
3.3.2. Uji kesesuaian sistem
Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan cara menyuntikkan salah satu larutan standar kolesterol sebanyak 7 kali ulangan, kemudian dihitung nilai SD dan RSD-nya dari waktu retensi dan
luas area peak yang dihasilkan. Dengan batas RSD ≤ 2,00.
15
3.3.3. Spesifisitas
Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara standar kolesterol, sampel telur dan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol.
3.3.4. Linieritas metode
Linieritas dilakukan dengan menginjeksikan larutan sample standar kolesterol enam konsentrasi yang berbeda 300 µgmL, 750 µgmL, 1500 µgmL, 3000 µgmL, 7500 µgmL, dan
15000 µgmL yang ditambahkan kedalam maktriks sampel sebanyak 3 g. Dilakukan tiga kali ulangan pada masing-masing konsentrasi kolesterol standar. Kemudian menghitung nilai standar deviasi dan
RSD. Linieritas diukur dengan nilai R
2
dari kurva hubungan antara luas area peak standar sebagai sumbu y dengan konsentrasinya mgg sebagai sumbu x. Linieritas yang baik adalah R
2
lebih dari 0,99.
3.3.5. Limit Deteksi Instrumen LDI
Limit Deteksi Instrumen LDI ditentukan dengan cara menyuntikkan standar kolesterol. Dilakukan dengan tujuh kali injeksi larutan standar dengan konsentrasi terendah yang dapat dideteksi
oleh HPLC-ELSD. Standar deviasi dari tujuh penentuan tersebut dihitung, kemudian nilai LDI ditentukan sebagai berikut:
Keterangan: = standar deviasi
= kadar reserpasi tiap ulangan = rata-rata kadar sampel
= jumlah ulangan Keterangan:
LDI = Limit Deteksi Instrumen
SD = standar deviasi
Hasil dari pengujian SD pada uji LDI digunakan untuk menguji LOQ dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan: LOQ
hitung
= Limit of Quantitation SD
= standar deviasi
16
3.3.6. Akurasi dan Presisi
Kategori