Validasi metode analisis kolesterol menggunakan HPLC–ELSD dengan matriks sampel telur ayam

(1)

METHOD VALIDATION OF CHOLESTEROL ANALYSIS USING HPLC - ELSD ON EGG AS SAMPLE MATRIX

Tika Setianingrum and Hanifah Nuryani Lioe

Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO BOX 220, Bogor, West Java, Indonesia

Phone: +62 813 15830421, E-mail: tika_sn@yahoo.com

ABSTRACT

A high-performance liquid chomatography (HPLC) method for the separation and quantification of cholesterol using an evaporative light-scattering detector (ELSD) is described. Detection of cholesterol was achieved in 1,50 until 1,53 minutes using cholesterol standard. A simplified binary mobile phase mixture of hexane and isopropanol (90:10) was used to separate cholesterol. Detection was accomplished with an ELSD, with the following settings: evaporation temperature 50 ºC, air pressure 2,2 bars, flow rate of mobile phase 2 mL/min and grain 7. A calibration curve was obtained from 0 to 5000 µg/g sample, the linear equation of cholesterol is y = 35,58x - 3140, with a correlation coefficient of 0,997. Instrument detection limit (IDL) was 1,07 µg/mL and limit of quantitation (LOQ) was 3,56 µg/mL. Recovery by spikin cholesterol standard in egg sample at low concentration was 122,13%, medium concentration was 108,23%, and high concentration was 44,71%. Methode detection limit (MDL) value was 2,30 µg/g sample. With intra reproducibility value was 0,04%.

(2)

1 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kolesterol merupakan jenis steroid yang paling dikenal. Dengan 27 karbon, kolesterol dibiosintesis dari lanosterol. Kolesterol terdapat dalam semua sel hewan terutama terkonsentrasi dalam otak dan sumsum tulang belakang. Kolesterol diperoleh dari hasil sintesis didalam hati. Bahan bakunya diperoleh dari karbohidrat, protein dan lemak. Jumlah yang disintesis bergantung pada kebutuhan tubuh dan jumlah yang diperoleh dari makanan. Menurut Almatsir (2001), batas anjuran konsumsi kolesterol dalam makanan adalah ≤ 300 mg/hari.

Keberadaan kolesterol hanya ditemukan pada pangan yang berasal dari hewan. Berikut adalah beberapa contoh kandungan kolesterol dalam produk pangan berdasarkan hasil penelitian USDA (2011). Kandungan kolesterol dalam produk daging dan olahannya adalah antara 262,00 mg/100g hingga 3010,00 mg/100g, untuk produk telur dan olahannya mencapai 356,00 mg/100g hingga 2335,00 mg/100g, untuk produk ikan dan olahannya mencapai 266,00 mg/100g hingga 766,00 mg/100g, dan produk ayam dan olahannya mencapai 262,00 hingga 568,00 mg/100g. Pangan nabati hanya terdapat sterol dalam bentuk fitosterol (Muchtadi, Palupi, dan Astawan 1993).

Menurut anjuran yang dikeluarkan oleh USDA (2011), produk pangan yang mengandung lebih dari 300,00 mg/100g sebaiknya untuk dihindari. Kecukupan asupan kolesterol yang dibutuhkan oleh tubuh dapat diperoleh dari bahan pangan yang dikonsumsi sehari-hari. Informasi mengenai kadar kolesterol dari berbagai bahan pangan yang dikonsumsi setiap harinya sangat penting untuk diketahui mengingat setiap jenis bahan pangan memiliki kandungan kolesterol yang berbeda-beda.

Kadar kolesterol di dalam bahan pangan dapat diukur dengan berbagai metode. Analisis diawali dengan proses ekstraksi, proses ini dipengaruhi oleh banyak hal. Salah satu hal yang paling penting menentukan dalam proses ekstraksi adalah matriks bahan pangan (Min dan Steenson 1998). Matriks bahan pangan adalah jaringan makanan tempat zat gizi terperangkap. Proses persiapan sampel berupa hidrolisis oleh asam dapat digunakan untuk menghilangkan interaksi yang menghambat tersebut. Menurut Min dan Streenson (1998), hidrolisis oleh asam dapat menyebabkan ikatan kovalen dan ikatan ionik pada molekul lemak menjadi terlepas. Adanya proses pelepasan ini menyebabkan lemak (kolesterol) menjadi mudah untuk diekstraksi.

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Osman dan Chin (2006), kolesterol dapat di deteksi dan ditentukan kuantitasnya dengan menggunakan beberapa metode seperti spektrofotometer UV-VIS, Gas Chromatografi, HPLC-UV detektor. Dengan menggunakan metode spektrofotometer UV-VIS dapat mendeteksi kolesterol hingga konsentrasi 14 µg/mL, menggunakan Gas Chromatografi dapat mendeteksi hingga 4,00 µg/mL, dan dengan menggunakan HPLC UV detektor dapat mendeteksi hingga 0,08 µg/mL kolesterol. Menurut Letter (1992), HPLC-ELSD dapat digunakan untuk mengklasifikasikan phospholipid (kolesterol, fosfatidiletanolamin, fosfatidilcerin, fosfatidikolin dan spingomielin) pada konsentrasi 350 µg/µL.

Penentuan kadar kolesterol dalam pangan sangat dipengaruhi oleh metode yang digunakan dalam menganalisisnya, baik pada saat ekstraksi maupun saat penentuan kuantitatifnya. Untuk menghindari ketidaksesuaian data hasil pengukuran yang dapat menyebabkan adanya kekeliruan, maka laboratorium harus memvalidasi metode tidak baku, metode yang didesain atau dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan, dan penegasan serta modifikasi dari metode baku (Hadi 2007). Validasi metode adalah suatu proses untuk mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis yang dilakukan untuk pengujian tertentu sesuai dengan tujuan yang diharapkan (Huber 2001). Penyimpangan dari hasil metode dapat dihindari pada kondisi normal, dapat

(3)

2

melakukan analisis dengan tingkat kepercayaan yang tinggi, mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis pada lingkup parameter tertentu, dan melakukan analisis sesuai dengan persyaratan metode yang baik sehingga dapat digunakan untuk analisis rutin.

1.2. Tujuan dan Manfaat Penelitian

Tujuan umum dari penelitian ini adalah mengembangkan metode deteksi dan kuantifikasi kolesterol bahan pangan dengan menggunakan metode deteksi analitik HPLC-ELSD. Dalam penelitian, HPLC-ELSD adalah jenis alat deteksi yang lebih sensitif dari HPLC-UV. Diperoleh komponen kolesterol yang dapat dideteksi terpisah dari matriks sampel makanan.

Tujuan khusus penelitian ini adalah untuk mengetahui optimasi teknik persiapan sampel, serta optimasi kondisi analisis HPLC-ELSD, untuk memperoleh komponen kolesterol yang dapat dideteksi terpisah dari matriks sampel makanan. Validasi metode analisis terdiri atas uji kesesuaian sistem, spesifisitas, linieritas metode, limit deteksi instrumen (LDI), rekoveri dan ripitabiliti, method detection limit (MDL) dan intra reprodusibilitas. Validasi metode dilakukan dengan menggunakan matriks telur ayam broiler (Gallus sp.). Pemilihan matriks telur ayam broiler (Gallus sp.) didasarkan atas banyaknya permintaan konsumen yang melakukan analisis kolesterol di LDITP. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah dapat mengetahui optimasi analisis kolesterol menggunakan HPLC-ELSD.

(4)

3 II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kolesterol

Kolesterol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dijumpai dalam hampir semua jaringan hewan. Kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan dalam biosintesis hormon steroid. Struktur kolesterol dapat dilihat pada Gambar 1a. Kolesterol memiliki 2 gugus metil yang terikat pada rantai C-13 dan C-10 dengan 5 ikatan rangkap. Rantai cabang hidrokarbon terikat pada atom C-17, sedangkan gugus hidroksil terdapat pada atom C-3. Kolesterol memiliki fungsi alkohol dan juga membentuk ester dengan asam lemak (ester sterol), sehingga termasuk kedalam senyawa yang paling hidrofobik diantara semua lipid didalam tubuh (Muchtadi, Palupi, dan Astawan 1993). Terdapat sedikit perbedaan struktur antara fitosterol (Gambar 1b.) dan kolesterol, yaitu sama-sama memiliki 1 gugus OH, namun berbeda pada rantai C-21. Fitosterol terdapat percabangan di rantai C-21 dan C-22, sedangkan pada kolesterol hanya ada 1 cabang yaitu pada C-22.

(a.)

(b.)

Gambar 1. Struktur kolesterol (a) dan fitosterol (b) (Hart 2003).

Steroid lain yang umum dijumpai dalam jaringan hewan dan memainkan peran biologis yang penting, seperti asam kolat, estradiol, dan progesteron (Hart 2003). Secara biologis, kolesterol merupakan prekursor penting dalam proses pembentukan asam empedu, provitamin D3 dan beberapa hormon steroid. Penentuan kolesterol secara akurat menjadi penting karena berhubungan erat dengan terjadinya penyakit jantung koroner. Penentuan kadar kolesterol dalam pangan sangat dipengaruhi oleh metode yang digunakan dalam menganalisisnya, baik pada saat ekstraksi maupun saat penentuan kuantitatifnya.

Kolesterol dan fitosterol merupakan jenis sterol yang berbeda keberadaannya. Menurut Bender (2001), kolesterol hanya terdapat dalam produk hewani dan tidak terdapat produk nabati. Jumlah kandungan kolesterol pada beberapa produk pangan dapat dilihat pada Tabel 1. berikut.

(5)

4

Tabel 1. Kandungan kolesterol pada beberapa produk pangan.

Jenis Pangan Jumlah kandungan kolesterol (mg/100g)

Produk daging sapi 57 – 100

Keju cheddar 100

Produk daging ayam 38 – 103

Produk ikan 42 – 70

Buah apel 0

Blackberries 0

Beras 0

Minyak babati 0

Sumber: Bender (2001).

Berdasarkan penelitian mengenai metode ekstraksi kolesterol yang dilakukan oleh Osman dan Chin (2006), penggunaan metode Bohac merupakan metode ekstraksi kolesterol yang memiliki nilai rekoveri yang paling baik dibandingkan metode Beyer dan Jensen, dan motede Queensland Health Science Institute (Tabel 2.). Haisl pengujian rekoveri yang dilakukan oleh Osman dan Chin (2006) dapat dilihat pada Tabel 2. berikut.

Tabel 2. Hasil uji rekoverikolesterol pada sampel matrik miyak sawit.

Instrumen Cara Ekstraksi

Konsentrasi kolesterol sebenarnya (mg/mL) * Konsentrasi kolesterol yang terdeteksi (mg/mL) RSD (%) Rekoveri (%) Spektrofotometer UV-VIS

- Bohac 0,3 0,26 6,66 86,67

- Beyer dan Jensen 0,3 0,11 18,17 36,67

- Queensland SE. 0,3 0,38 18,42 126,67

HPLC-UV detector

- Bohac 0,3 0,29 7,50 96,67

- Beyer dan Jensen 0,3 0,22 9,10 73,33

- Queensland SE 0,3 0,33 9,56 110

Gas

Chromatography

- Bohac 0,3 0,25 28,57 83,33

- Beyer dan Jensen 0,3 0,18 51,23 60,00

- Queensland SE 0,3 0,44 34,38 146,67

Keterangan: * = rata-rata dari 8 kali ekstraksi. Sumber: Osman, Chin (2006).

Instrumen yang bisa digunakan untuk mengetahui kualitas dan kuantitas kolesterol dalam pangan menurut Osman dan Chin (2006) adalah Spektofotometer UV-VIS, HPLC-UV detector, dan GC dengan tingkat sensitifitas yang berbeda-beda (Tabel 3). Berdasarkan tabel tersebut diketahui bahwa instrumen HPLC-UV detector memiliki tingkat sensitifitas yang paling baik, karena memiliki nilai LOD dan LOQ yang paling rendah.

(6)

5

Tabel 3. Tingkat sensitifitas instrumen terhadap kandungan kolesterol pada sampel (Osman dan

Chin 2006). Instrumen Kandungan kolestrol sebenarnya (mg) Ketepatan * LOD (μg/mL)

LOQ (µg/mL) Pengukuran (mg) RSD (%)

Spektrofotometer UV-VIS 0,27 0,203 ± 0,032 5,76 13 15

HPLC UV detector 0,27 0,263 ± 0,013 4,94 0,08 0,60

Gas Chromatography 0,27 0,202 ±0,048 23,76 4,00 13

Keterangan * n = 8

2.2. Kandungan Kolesterol dalam Telur dan Analisisnya

Komposisi fisik dan kualitas telur ayam dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya bangsa ayam, umur, musim, penyakit, lingkungan (suhu dan kelembaban), pakan dan sistem pengelolaan ayam tersebut (Rahayu 2003), yang pada gilirannya kualitas ini akan berperan pada keputusan konsumen dalam menentukan pilihan.

Struktur telur terbagi atas tiga bagian utama yaitu cangkang telur, putih telur dan kuning telur. Menurut Anton (2007), kolesterol dalam telur hanya ditemukan di bagian kuning telur. Hal ini dikarenakan lemak pada kuning telur mencapai 30,5% sedangkan di bagian putihnya hanya 0,0% perberat kering telur. Berikut adalah komposisi kimia dari telur (Tabel 4).

Tabel 4. Komposisi kimia telur ayam.

Komponen Putih Telur Kuning Telur Telur Utuh

Kadar air (g/100g) 88,3 51 75,1

Protein (g/100g) 9,0 16,1 12,5

Lemak (g/100g) 0,0 30,5 10,8

Karbohidrat (g/100g) 0,0 0,0 0,0

Kalori (kj/100g) 151 1419 615

Kolesterol (mg/100g) 0,0 1120 385

Keterangan : - = tidak dianalisis. Sumber: Bender (2001).

Perbandingan kandungan kolesterol dalam berbagai jenis telur dapat dilihat pada Tabel 5. Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa pada telur ayam (kuning telur) memiliki kandungan kolesterol yang lebih tinggi dibandingkan jenis produk lainnya.

Matriks pangan pada telur sangat beragam, mulai dari karbohidrat, protein, lemak, dan fosfolipid (Astawan 2008). Oleh karena itu diperlukan perlakuan hidrolisis oleh asam untuk melepaskan lemak yang terkandung pada telur. Lemak pada telur terdiri dari trigliserida (lemak netral), fosfolipida yang umumnya berupa lesitin dan kolesterol (Astawan 2008). Skema keterikatan kolesterol dalam kuning telur dapat dilihat pada Gambar 2.

(7)

6

Tabel 5. Kandungan kolesterol dalam telur dan produknya.

No. Sumber kolesterol dalam makanan Kandungan kolesterol

dalam mg/ 100 g produk

1 Telur ayam, kuning telur, kering 2335,00

2 Telur ayam, utuh, kering, 2017,00

3 Telur ayam, utuh, kering 1715,00

4 Telur ayam, kuning telur, mentah, segar 1234,00

5 Telur ayam, kuning telur, mentah, beku 1075,00

6 Telur ayam, kuning telur, mentah, beku, ditambah gula 959,00

7 Telur ayam, kuning telur, mentah, beku, ditambah garam 955,00

8 Telur, kalkun, utuh, segar, mentah 933,00

9 Telur, bebek, utuh, segar, mentah 884,00

10 Telur, angsa, utuh, segar, mentah 852,00

11 Telur, puyuh, utuh, segar, mentah 844,00

12 Telur ayam sustitusi, bubuk 572,00

13 Telur ayam, utuh, masak, goreng 457,00

14 Telur ayam, utuh, mentah, beku 432,00

15 McDONALD'S, Telur ayam acak 427,00

16 Fast foods, telur ayam, acak 426,00

17 Telur ayam, utuh, masak, rebus matang 424,00

18 Telur ayam, utuh, mentah, segar 423,00

19 Telur ayam, utuh, masak, kukus tanpa kulit 422,00

20 Telur ayam, utuh, masak, omelet 356,00

21 Telur ayam, utuh, masak, acak 352,00

Sumber: USDA (2011).

Gambar 2. Skema keterikatan kolesterol dalam matriks kuning telur (Anton 2007).

Analisis yang bisa digunakan untuk mengukur jumlah kolesterol dalam produk pangan adalah metode Lieberman-Buchard Color Reaction (Arifin 2005) yang menggunakan alat Spektrofotometer. Hasil yang diperoleh pada pengukuran kandungan kolesterol kuning telur yang dijual di pasar berdasarkan analisis tersebut adalah 25,68 mg/g (Wardiny 2006). Metode lain yang dapat digunakan dalam mengukur kadar kolesterol dalam telur adalah digunakan dengan metode Gas-Liquid Chromatographic (GLC), dengan menggunakan metode ini dapat diketahui kolesterol total dan kolesterol bebas dengan nilai rekoverimencapai 99.5% ± 0.6. Total kolesterol yang diperoleh adalah 0,326 mg/g pasta telur (Agulló dan Gelós 1996). Menurut Letter (1992), kandungan kolesterol dalam

(8)

7

kuning telur kering adalah 1,50 mg/mL yang dianalisis menggunakan HPLC-ELSD. Berikut adalah hasil analisis kuning telur kering dengan menggunakan instrumen HPLC-ELSD (Gambar 3).

Gambar 3. Klasifikasi phospholipid dalam kuning telur kering dengan menggunakan HPLC - ELSD (1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilkolin dan 4. spingomielin).

2.3. Analisis Dengan Menggunakan HPLC – ELSD

HPLC adalah instrumen yang sering digunakan untuk mengindentifikasi komponen pangan. Komponen yang diidentifikasi dengan HPLC harus larut dalam pelarut yang juga berperan sebagai fase gerak. Dengan adanya interaksi komponen dengan fase diam menyebabkan komponen akan keluar dengan waktu retensi yang berbeda. Komponen standar dari HPLC adalah gradien controller, pompa/sistem dampning, sampel introduction, column/precolumn, detektor, dan data hasil (Gambar 4.).

Gambar 4. Komponen standar HPLC.

a b c

Keterangan:

a = pengontrol laju fase gerak d = kolom b = pompa e = detektor c = sempel injektor f = data output

(9)

8

Terdapat berbagai jenis detektor yang dapat digunakan pada instrumen HPLC seperti UV-VIS, RI, dan ELSD. Detektor UV-Vis memiliki sensitivitas yang bagus, dan juga paling seletid terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh. Detektor RI merupakan detektor yang bersifat universal setelah detektor VIS, memiliki tingkat sensitivitas yang lebih rendah dari detektor UV-VIS, dan dangat sensitif terhadap perubahan suhu sekitar. Detektor RI tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Menurut Megoulas dan Koupparis (2005), HPLC-ELSD adalah suatu detektor universal, yang mempunyai tingkat selektivitas rendah dan dapat digunakan untuk menganalisis sampel yang memiliki matrik kompleks.

HPLC-ELSD telah digunakan untuk mengklasifikasikan phospholipid pada konsentrasi 350µg/µL (Letter 1992). Penentuan kolesterol dianggap penting karena korelasi yang erat terhadap terjadinya penyakit jantung koroner. Metode analisis kolesterol sebelumnya sangat bergantung pada metode spektroskopi dan gravimetri. Metode spektrofotometer didasarkan pada pengukuran secara enzimatik dan digunakan untuk analisis kolesterol dalam darah, sehingga tidak cocok untuk diaplikasikan pada sampel makanan. Metode kromatografi lebih handal, selektif, dan akurat karena gangguan dari sterol lainnya dapat dihindari. Menurut Graeve dan Janssen (2009), diketahui bahwa HLPC-ELSD dengan kolom silika mampu memisahkan 16 kelas lipid.

Terdapat tiga tahapan proses dalam pengoperasian HPLC-ELSD yaitu Nebulization, Evaporation dan Detection (Megoulas, Koupparis 2005) (Gambar 5.). Tahap nebulization adalah ketika kolom eluen melalui sebuah jarum dan bercampur dengan gas nitrogen dan membentuk dispersi droplets. Tahap kedua adalah tahap evaporation, droplet melewati pemanas (driff tube) dimana fase bergeraknya terevaporasi. Tahap ketiga adalah tahap detection, partikel sampel melewati sebuah sell dan mengenai cahaya laser beam yang menyebar. Adanya deteksi cahaya tersebut akan memberikan sinyal.

Gambar 5. Tahapan proses HPLC-ELSD.

Penggunaan instrumen HPLC-ELSD diantaranya memiliki sensitivitas yang cukup baik dibandingkan dengan HPLC-UV. Berikut ini adalah contoh perbandingan hasil pengukuran steroid pada konsenstrasi yang sama dengan menggunakan alat HPLC-UV dengan HPLC-ELSD (Gambar 6.) Hasil pada Gambar 6. menunjukkan tinggi masing-masing puncak pada HPLC-ELSD lebih besar dibandingkan tinggi puncak pada hasil HPLC-UV, selain itu signal per noise ratio pada HPLC-ELSD terlihat lebih besar daripada HPLC-UV. Menurut Cunha dan Oliveira (2006), menyatakan bahwa HLPC-ELSD memiliki respon yang tidak linier pada konsentrasi sampel yang sangat rendah ataupun sangat tinggi.

(10)

9

Gambar 6. Perbandingan hasil pengukuran konsentrasi steroid dengan menggunakan HPLC-UV

dan HPLC-ELSD.

Kondisi pengujian pada Gambar 6. dapat dilihat pada Tabel 6. berikut.

Tabel 6. Kondisi pengujian kalasifikasi steroid menggunakan HPLC-UV dan HPLC-ELSD.

Kondisi Instrumen

HPLC-UV HPLC-ELSD

Kolom ProntoSIL 120-3-C18 H ProntoSIL 120-3-C18 H

Eluent MeOH MeOH

Laju Alir 0,65 0,65

Detektor UV (200 nm) ELSD (PMT gain, T = 40 ºC)

Suhu 30 ºC 30 ºC

Jumlah larutan yang di injeksikan 5 µL 5 µL

Konsentrasi masing – masing 70 ppm 70 ppm

Sumber : anonim (2011).

Menurut Letter (1992), HPLC-ELSD juga mampu mengidentifikasi jenis-jenis sterol dengan jelas pada konsentrasi 350 µg/µL. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7 berikut. Kolesterol muncul di peak no 1 dengan waktu retensi kurang dari 2 menit.

Keterangan Sampel: 1: hydrocortisone 2: progesterone 3: cholecalciferol 4: ergocalciferol 5: ergosterol 6: kolesterol

(11)

10

Gambar 7. Kromatogram dari 6 klasifikasi phospholipid standar yang di injeksikan kedalam

HPLC-ELSD (1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilserin, 4. fosfatidilkolin dan 5. spingomielin) yang masing-masing sebanyak 350µg/µL.

2.4. Validasi Metode Analisis

Validasi metode menurut JECFA (2006), direkomendasikan untuk memastikan bahwa suatu metode dapat menghasilkan data yang akurat dan dapat dipercaya. Validasi dipergunakan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Selain itu, validasi metode dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode terdahulu, atau terjadi perubahan metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi metode analisis yaitu untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapat ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul.

Validasi metode dilakukan dengan cara melakukan Ketelitian (precision), akurasi (accuracy), batas deteksi atau limit of detection (LOD), batas kuantitatif atau limit of quantitation (LOQ), selektivitas (specificity), linieritas, ketangguhan (ruggedness), uji kekuatan (robustness) dan kesesuaian sistem (Gambar 8). Terdapat beberapa rujukan validasi metode seperti United State Pharmacopoeia (USP), British Pharmacopoeia (BP), Association of Official Analytical Chemistry (AOAC), International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) dan International Conference on Harmonizaton (ICH). Penelitian ini mengacu pada petunjuk validasi dari JECFA (2006), meliputi pengujian presisi, akurasi, LOD, batas penentuan (Limit Of Determination), linieritas, rekoveri, dan sensitifitas.

1

2

(12)

11

Gambar 8. Metode validasi.

Uji ketelitian (presisi) digunakan untuk mengevaluasi tingkat kedekatan antara hasil tes individu sampel tertentu sehingga diketahui kesalahan acak analisis (Harmita 2004). Uji ketelitian tidak berhubungan dengan nilai benar atau tidaknya nilai tersebut. Ukuran ketelitian biasanya dinyatakan dalam ketidaktepatan dan dihitung sebagai RSD dari hasil uji. Uji ketelitian dapat berupa uji keterulangan (ripitabilitas) dan ketertiruan (reprodusibilitas).

Uji ripitabilitas adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi yang sama dan dalam interval waktu yang pendek (Harmita 2004). Ripitabilitas dilakukan dengan menggunakan sampel yang identik dari batch yang sama, sehingga dapat memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Persen ripitabilitas yang dapat diterima, dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Keterimaan persen RSD untuk uji ripitabilitas.

Analat (%) Unit RSD(%)

100 100 % 1,3

10 10 % 2,8

1 1 % 2,7

0,1 0,10 % 3,7

0,01 100 ppm 5,3

0,001 10 ppm 7,3

0,0001 1 ppm 11

0,00001 100 ppb 15

0,000001 10 ppb 21

0,0000001 1 ppb 30

0,00000001 0,1 ppb 43

Sumber: AOAC (1993).

Reprodusibilitas adalah keseksamaan metode yang dikerjakan pada kondisi berbeda. Analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik serta

Metode

validasi

Ketelitian

Akurasi

Batas deteksi

Batas Kuantitatif

Selektivitas

Linieritas

Ketangguhan

Uji kekuatan

Kesesuaian Sistem

(13)

12

dari batch yang sama. Reprodusibilitas dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda. Percobaan ketelitian dilakukan terhadap paling sedikit tujuh replika sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen (AOAC 1993).

Akurasi adalah kemampuan suatu alat ukur untuk memberikan respon yang dekat dengan nilai sebenarnya (Harmita 2004). Akurasi juga dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (rekoveri) analit yang ditambahkan. Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi ( spiked-placebo recovery) atau metode adisi (standard addition method).

Metode simulasi dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit bahan murni ke dalam plasebo (semua campuran reagent yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo, maka dapat dipakai metode adisi. Dalam metode adisi, sampel dianalisis untuk diketahui komposisi awal analitnya, kemudian sampel ditambahkan sejumlah tertentu standar dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang ditambahkan).

Hasil uji rekoveri dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya, sehingga akan diketahui nilai analisis error sistematisnya. Analisis dilakukan pada kondisi yang sama antara sampel dan sampel yang ditambahkan standar. Kesalahan sistematis adalah sama dengan minus kesalahan acak dan penyebab dari kesalahan ini tidaklah diketahui. Persen rekoveri yang dapat diterima dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Keterimaan persen rekoveri.

Analat (%) Unit Rata-Rata Rekoveri(%)

100 100 % 98 – 102

10 10 % 98 – 102

1 1 % 97 – 103

0,1 0,10 % 95 – 105

0,01 100 ppm 90 – 107

0,001 10 ppm 80 – 110

0,0001 1 ppm 80 – 110

0,00001 100 ppb 80 – 110

0,000001 10 ppb 60 – 150

0,0000001 1 ppb 40 – 120

Sumber: AOAC (1993).

Uji Limit of Detection (LOD) merupakan konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan memberikan respon yang signifikan oleh alat (Harmita 2004), tetapi konsentrasi tersebut belum tentu dimiliki oleh sampel yang diujikan. Menurut AOAC (1993), LOD disebut juga Instrument Detection Limit (IDL) atau Limit Deteksi Instrumen (LDI). Pengujian LDI dilakukan dengan 7 kali ulangan, kemudian dihitung standar deviasinya. LDI, dinyatakan oleh persamaan:

Keterangan:

LDI = Limit Deteksi Instrumen

x = rata-rata hasil pembacaan blanko sampel

(14)

13

Uji Limit of Quantitation (LOQ) menurut Harmita (2004) adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurat dan presisi. Harmita (2004) menyatakan bahwa prinsip uji LOQ pada metode yang menggunakan instrumen dilakukan dengan membuat sederet blanko contoh sebanyak 7 – 10 kali ulangan. LOQ dinyatakan oleh persamaan:

Keterangan:

LOQ = Limit of Quantitation SD = standar deviasi

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu secara akurat dan presisi walaupun terdapat komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita 2004). Selektivitas dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode terhadap sampel yang mengandung cemaran seperti hasil urai atau senyawa sejenis atau senyawa asing lainnya, kemudian dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung cemaran.

Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, atau senyawa asing lainnya. Uji selektivitas dapat pula ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak digunakan lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivita

Linieritas mendefinisikan kemampuan metode untuk mendapatkan hasil uji proporsi dengan konsentrasi analit. Batas linier merupakan kisaran konsentrasi analit dimana metode yang memberikan hasil tes proporsional terhadap konsentrasi analit dan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linieritas yang dapat diterima. Jika terdapat hubungan yang linear, hasil uji harus dievaluasi lebih lanjut secara statistik dengan perhitungan garis regresi. Dalam penentuan linieritas, direkomendasikan untuk menggunakan minimum lima konsentrasi (EMA 1995).

Perlakuan matematik dalam pengujian linieritas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 – 150% kadar analit dalam sampel. Linieritas yang baik adalah R2 lebih dari 0,99 (EMA 1995).

Ketangguhan metode (ruggedness) adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboraturium dan antar analis.

Uji kekuatan (Robustness) dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan metodologi yang kecil yang terjadi terus menerus. Uji kekuatan juga berfungsi untuk mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah.

(15)

14 III. METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, mulai bulan Maret 2011 sampai dengan Agustus 2011. Berlokasi di Laboratorium Jasa Analisis Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Kampus IPB Darmaga P.O. Box 220, Bogor 16002. Telp. (0251) 8629855 Faks. (0251) 628855.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan adalah telur ayam broiler (Gallus sp.) yang diperoleh dari pasar lokal di sekitar Bogor. Pereaksi yang digunakan adalah metanol, KOH, heksan, gas N2 teknis, gas N2

HP (high purity), HCl, 2–propanol (isopropanol), standar kolesterol kemurnian 95% (Sigma Chemical Inc, USA), aqua demineralisasi, Na2SO4anhidrous, dan kertas saring.

Alat yang digunakan pada penelitian ini mencakup neraca analitik (Kern & Sohn, Jerman), vortex, waterbath, HPLC LC 6A (Shimadzu, Jepang), kolom normal phase LiChrosorb Si 60 (10µm) (25 cm x i.d. 4,6 cm) (Merck, Jerman), detektor ELSD Sedex 55 (Sedere, Prancis). Alat gelas yang digunakan seperti tabung reaksi bertutup, labu pemisah, pipet tetes, corong gelas, erlenmeyer, baker glass, sudip, pipet volumetrik, pipet mikro (Biohit Proline), pipet Mohr, syringe dan pipet tetes.

3.3. Metode Penelitian

Metode penelitian yang dilakukan meliputi uji kesesuaian sistem, spesifisitas, pengukuran linieritas metode, limit deteksi instrumen (IDL), ketepatan (akurasi), ketelitian (presisi), method detection limit (MDL), dan intra reprodusibilitas.

3.3.1. Pemilihan dan preparasi sampel

Sampel yang dipergunakan adalah telur ayam broiler (Gallus sp.). Sampel ini diperoleh pasar disekitar kota Bogor. Jumlah sampel yang dibeli adalah satu kotak (10 butir). Preparasi sampel diawali dengan pencampuran 10 butir telur dalam sebuah wadah, kemudian dikocok hingga tercampur rata. Sampel yang telah tercampur rata kemudian di masukkan kedalam 15 kantung plastik kecil dan disimpan dalam lemari pembeku dengan suhu - 18ºC.

3.3.2. Uji kesesuaian sistem

Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan cara menyuntikkan salah satu larutan standar kolesterol sebanyak 7 kali ulangan, kemudian dihitung nilai SD dan RSD-nya dari waktu retensi dan luas area peak yang dihasilkan. Dengan batas RSD ≤ 2,00%.

(16)

15 3.3.3. Spesifisitas

Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara standar kolesterol, sampel telur dan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol.

3.3.4. Linieritas metode

Linieritas dilakukan dengan menginjeksikan larutan sample standar kolesterol enam konsentrasi yang berbeda (300 µg/mL, 750 µg/mL, 1500 µg/mL, 3000 µg/mL, 7500 µg/mL, dan 15000 µg/mL) yang ditambahkan kedalam maktriks sampel sebanyak 3 g. Dilakukan tiga kali ulangan pada masing-masing konsentrasi kolesterol standar. Kemudian menghitung nilai standar deviasi dan RSD. Linieritas diukur dengan nilai R2 dari kurva hubungan antara luas area peak standar (sebagai sumbu y) dengan konsentrasinya (mg/g) (sebagai sumbu x). Linieritas yang baik adalah R2 lebih dari 0,99.

3.3.5. Limit Deteksi Instrumen (LDI)

Limit Deteksi Instrumen (LDI) ditentukan dengan cara menyuntikkan standar kolesterol. Dilakukan dengan tujuh kali injeksi larutan standar dengan konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Standar deviasi dari tujuh penentuan tersebut dihitung, kemudian nilai LDI ditentukan sebagai berikut:

Keterangan:

= standar deviasi

= kadar reserpasi tiap ulangan = rata-rata kadar sampel = jumlah ulangan

Keterangan:

LDI = Limit Deteksi Instrumen SD = standar deviasi

Hasil dari pengujian SD pada uji LDI digunakan untuk menguji LOQ dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Keterangan:

LOQhitung = Limit of Quantitation

(17)

16 3.3.6. Akurasi

dan

Presisi

Akurasi dilakukan dengan menguji rekoveri. Uji ini dilakukan dengan menggunakan sampel spike pada tiga konsentrasi kolesterol berbeda dari matriks sampel. Konsentrasi spiking yang dicobakan adalah konsentrasi rendah (sama dengan konsentrasi LOQhitung), konsentrasi sedang (lima

kali konsentrasi LOQhitung), dan konsentrasi tinggi (konsentrasi kolesterol tertinggi dalam matriks).

Percobaan spiking dilakukan sebanyak tujuh kali ulangan. Kemudian dihitung hasil rekoveri standar dengan menggunakan rumus berikut:

Presisi dilakukan dengan mengukur ripitabilitas. Uji ini dilakukan dengan menggunakan sampel spike pada tiga konsentrasi kolesterol berbeda dari matriks sampel. Konsentrasi spiking yang dicoba adalah konsentrasi rendah (sama dengan konsentrasi LOQhitung), konsentrasi sedang (lima kali

konsentrasi LOQhitung), dan konsentrasi tinggi (konsentrasi kolesterol tertinggi dalam matriks).

Percobaan spiking dilakukan sebanyak tujuh kali ulangan. Kemudian dihitung nilai SD dan RSD-nya sebagai berikut:

Keterangan:

= standar deviasi

= kadar reserpasi tiap ulangan = rata-rata kadar reserpin = jumlah ulangan

3.3.7. Method Detection Limit

(MDL)

Method Detection Limit (MDL) ditentukan dengan menginjeksikan 3 konsetrasi spiking standar kolesterol yang berbeda. Konsentrasi spiking yang dicobakan adalah konsentrasi rendah (sama dengan konsentrasi LOQhitung), konsentrasi sedang (lima kali konsentrasi LOQhitung), dan konsentrasi tinggi

(konsentrasi kolesterol tertinggi dalam matriks). Masing-masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak 7 kali ulangan, kemudian dihitung standar deviasi per konsentrasi yang ditambahkan. Dari 3 nilai standar deviasi tersebut, kemudian diplotkan kedalam kurva hubungan antara konsentrasi standar (sumbu x) yang ditambahkan dengan standar deviasinya (sumbu y). Nilai interpolasi pada x sama dengan nol sebagai SD0. Nilai MDL dihitung sebagai 3 kali nilai SD0.

3.3.8. Intra Reprodusibilitas

Reprodusibilitas (menggunakan satu operator, satu laboratorium pada jangka waktu yang pendek namun berbeda hari) dilakukan dengan menggunakan satu sampel matriks dan dilakukan tiga kali ulangan untuk setiap matriks di hari yang sama. Kemudian dihitung nilai standar deviasinya dan RSD dengan menggunakan rumus berikut:

(18)

17

Keterangan:

= standar deviasi

= kadar reserpasi tiap ulangan = rata-rata kadar reserpin = jumlah ulangan

3.4. Prosedur Analisis Kolesterol

Prosedur analisis yang dilakukan diawali dengan melakukan persiapan larutan standar kolesterol, persiapan sampel pada matriks telur dan analisis menggunakan HPLC-ELSD.

3.4.1. Persiapan larutan standar kolesterol:

Larutkan 50 mg standar kolesterol powder dalam 50 mL fase gerak (heksan:isopropanol = 90:10) dan larutan 150 mg standar kolesterol powder dalam 50 mL fase gerak. Larutan standar stok ini mempunyai konsentrasi 1000 µg/mL dan 15000 µg/mL. Dilanjutkan dengan pengenceran larutan stok untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL, 250 µg/mL, 300 µg/mL, 500 µg/mL, 750 µg/mL, 1500 µg/mL, 3000 µg/mL, dan 7500 µg/mL.

3.4.2. Persiapan sampel pada matriks telur (AOAC 976.26.):

Timbang sekitar 3 g sampel telur (yang telah di homogenkan) kedalam tabung reaksi bertutup, tambahkan 10 mL larutan HCl (4:1) lalu vortex hingga tercampur. Untuk sampel yang diberi perlakuan spiking, sebelum penambahan HCl sampel diberi tambahan kolesterol standar sebanyak 1 mL untuk setiap konsentrasi. Dilanjutkan dengan penghembusan dengan N2 selama 30 detik lalu tutup

dengan segera untuk menghindari oksidasi kolesterol. Kemudian panaskan pada waterbath mendidih selama 30 menit, sambil dikocok setiap 5 menit. Dinginkan tabung reaksi tersebut menggunakan air mengalir. Pindahkan isi tabung ke dalam labu pemisah (250 mL), bilas tabung reaksi tersebut dengan 2 x 10 mL air bebas ion, lalu gabungkan air bilasan tersebut ke dalam labu pemisah. Cuci dengan heksan 3 x 10 mL sambil dikocok. Ambil fraksi heksan lalu uapkan fraksi heksan dengan gas N2.

Setelah kering, saponifikasi dengan 10 mL metanolik KOH 2% dengan pemanasan 80 ºC, 30 menit. Kemudian ekstrak dengan heksan 3 x 10 mL dalam labu pemisah dan saring dengan menggunakan kertas saring yang diberi tambahan Na2SO4anhidrous. Uapkan fraksi heksan dengan gas N2. Setelah

kering, larutkan dengan fase gerak pada volume tertentu (1,0 mL). Kemudian larutan tersebut diencerkan sebanyak 10 kali tingkat pengenceran. Larutan sampel ini siap diinjeksikan ke HPLC.

(19)

18 3.4.3. Pengukuran dengan HPLC-ELSD

Analisis dengan HPLC-ELSD kondisi isokratik menggunakan:

Fase gerak : Heksan: 2-propanol (90:10)

Kolom : silica (25 cm x i.d. 4,6 cm)

Laju alir : 2 mL/menit

Suhu : 50 ºC

Detektor : ELSD (Sedex 55) dengan tekanan gas N2 sebesar2,2 bar, Gain 7.

Volume injeksi : 20 µL

Injeksikan sampel terpisah dengan injeksi standar dengan menggunakan kondisi HPLC diatas, kemudian area respon dicatat. Buat kurva standar hubungan linier antara area dengan konsentrasi kolesterol standar. Area dari sampel dihubungkan dengan kurva standar untuk memperoleh konsentrasi kolesterol standar dari kurva (µg/mL). Lakukan perhitungan konsentrasi kolesterol dalam sampel dengan rumus:

Keterangan:

Fp = faktor pengenceran dari larutan sampel akhir apabila dilakukan pengenceran sebelum larutan diinjeksikan ke HPLC.

(20)

19 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Metode ekstraksi kolesterol yang dilakukan pada penelitian ini merupakan metode yang tercantum dalam AOAC 976.26. Pertama-tama dengan dilakukan ekstraksi menggunakan asam (HCl 4:1), yang kemudian dilakukan tahap saponifikasi menggunakan KOH 2% seperti pada sub bab 3.4.

4.1. Uji Kesesuaian Sistem

Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 9. berikut. Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa luas area yang didapat adalah 50,9489 mV.s dengan RSD sebesar 2,23%. Waktu retensi yang diperoleh adalah rata-rata berkisar 1,52 menit dengan nilai RSD sebesar 0,59%.

Tabel 9. Hasil uji kesesuaian sistem analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC - ELSD. Ulangan Konsentrasi Kolesterol

Standar (μg/mL) Luas Area (mV.s)

Waktu Retensi (menit)

1 50 50,1387 1,527

2 50 51,8594 1,520

3 50 52,2730 1,520

4 50 50,0535 1,527

5 50 51,4215 1,540

6 50 51,6683 1,513

7 50 49,2280 1,533

Rata-Rata 50,9489 1,526

SD 1,14 0,01

RSD (%) 2,23 0,59

Waktu retensi yang dihasilkan memiliki sedikit perbedaan untuk setiap ulangan, hal ini dikarenakan alat HPLC yang digunakan belum secara otomatis dapat mendeteksi sempel setelah diinjeksikan kedalam kolom.

4.2. Uji Spesifisitas

Uji spesifisitas dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara standar kolesterol, sampel telur dan sampel telur yang diberi tambahan standar kolesterol. Berikut adalah gambar hasil injeksi standar kolesterol pada konsentrasi 1014 µg/mL (Gambar 9.). Diketahui bahwa kolesterol terdeteksi dan memiliki waktu retensi pada menit ke 1,53.

(21)

20

Gambar 9. Hasil injeksi standar kolesterol 1014 µg/mL.

Spesifisitas analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC-ELSD dilakukan dengan mengukur pada sampel telur dan sampel telur yang ditambahkan standar kolesterol. Pengujian sampel telur tanpa penambahan standar kolesterol (Gambar 10.) dan sampel telur dengan penambahan 507 µg/mL kolesterol standar (Gambar 11.), diketahui bahwa pada menit ke 1,5 terbentuk peak. Hal tersebut menunjukkan bahwa kolesterol yang ditandai dengan kemunculan peak yang sama dengan standar kolesterol (pada menit ke 1,5). Peak yang terbentuk memiliki baseline yang tidak merata, dimungkinkan karena adanya komponen sterol lain yang ikut seperti fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin,. fosfatidilkolin dan spingomielin.

(22)

21

Gambar 11. Hasil injeksi sampel yang ditambahkan kolesterol standar 507 µg/mL.

4.3. Linieritas Metode

Pengujian linieritas motede analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC – ELSD menghasilkan kurva linieritas yang proporsional. Semakin tinggi konsentrasi kolesterol standar yang ditambahkan akan semakin tinggi dan luas peak-nya.

Konsentrasi kolesterol standar yang ditambahkan pada pengukuran linieritas ini berkisar antara 50 µg/g sampel hingga 3000 µg/g sampel. Hasil pengukuran linieritas metode dapat dilihat pada Lampiran 1. yang kemudian di plotkan kedalam sebuah kurva linieritas metode pada Gambar 12. Berdasarkan kurva tersebut dihasilkan linieritas dengan persamaan y = 35,85x – 4088 yang mempunya nilai R² sebesar 0,997. Dengan nilai R² tersebut menunjukkan bahwa metode analisis kolesterol menggunakan HPLC-ELSD ini memiliki linieritas yang baik, karena R² telah melebihi 0,99 (EMA 1995).

Gambar 12. Kurva linieritas metode analisis kolesterol dengan adisi standar ke dalam sampel menggunakan HPLC-ELSD.

Hasil uji linieritas metode yang dilakukan, menunjukkan nilai R2 yang lebih baik apa bila dibandingkan dengan dengan metode yang dilakukan oleh Osman dan Chin (2006). Penelitian yang dilakukan Osman dan Chin nilai R2 pada metode ekstraksi Bohac adalah 0,993, metode Beyer & Jensen adalah 0,9897, dan metode Queensland Health Science Institute mencapai 0,9411 (Tabel 10.).

y = 35,58x - 3140, R² = 0,997

0 50000 100000 150000 200000

0 2000 4000 6000

Lu a s A re a ( m V. s)

(23)

22

Ketiga metode tersebut menggunakan istrumen HPLC UV-VIS detector dengan 8 kali ulangan. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang menggunakan HPLC-ELSD menghasikan nilai linieritas yang lebih baik. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Avalli dan Contarini (2005), yang menyatakan bahwa HPLC-ELSD dapat menghasilkan respon yang linier untuk mengukur phospholipid di dalam produk susu.

Tabel 10. Perbandingan hasil uji linieritas penulis dengan penelitian Osman dan Chin (2006).

Peneliti Metode Ektraksi Instrumen Hasil uji

Linieritas (R2)

Penulis AOAC 976.26 HPLC -ELSD 0,997

Osman dan Chin Bogac HPLC-UV VIS 0,993

Beyer & Jensen HPLC-UV VIS 0,9897

Queensland Health Science Institute HPLC-UV VIS 0,9411

4.4 Limit Deteksi Instrumen

Limit kuantitatif adalah batas konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh alat. Pengujian ini pertama-tama dilakukan dengan penginjeksian kolesterol standar dari konsentrasi 10,14 μg/mL hingga 1014 μg/mL. Hasil dari pengukuran ini kemudian di plotkan kedalam sebuat kurva standar hubungan antara konsentrasi kolesterol standar dengan luas area yang dihasilkan persamaan y = 3,195x – 106,8 dengan R2 = 0,997. Diketahui bahwa pada konsentrasi 10,14 μg/mL dan 25,35 μg/mL, tidak dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD. Kolesterol dapat dideteksi mulai pada konsentrasi 50,7 μg/mL hingga 1014 μg/mL. Dapat disimpulkan bahwa konsentrasi kolesterol terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah 50,7 μg/mL. Data selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 13 dan terlampir pada Lampiran 2A.

Gambar 13. Kurva standar kolesterol 10,14 – 1014,00 μg/mL tanpa menggunakan matriks telur ayam. Berdasarkan gambar tersebut diketahui bahwa konsentrasi kolesterol terendah yang dapat dideteksi oleh HPLC-ELSD adalah 50 μg/mL. Pengujian LDI dilanjutkan dengan 7 kali penginjeksian standar kolesterol pada konsentrasi 50 μg/mL yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 11.

y = 3,195x - 106,8 R² = 0,997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

0 200 400 600 800 1000 1200

Lu a s A re a ( m V .s )

(24)

23

Tabel 11. Hasil pengukuran LDI* pada konsentrasi kolesterol 50 μg/mL.

Ulangan Konsentrasi Kolesterol Standar (μg/mL) Konsentrasi Kolesterol yang Terbaca (μg/mL)

1 50 49,1201

2 50 49,6587

3 50 49,7881

4 50 49,0934

5 50 49,5216

6 50 49,5988

7 50 48,8351

Rata-Rata 49,3737

SD 0,36

RSD (%) 0,72

LDI (µg/mL) 1,07

LOQ** hitung (µg/mL) 3,57

Ket : * LDI = Limit Deteksi Instrumen ** LOQ = Limit of Quantitation

Limit Kuantitasi (LOQhitung) merupakan batas terendah konsentrasi kolesterol yang dapat

dilaporkan, di bawah konsentrasi ini disebut sebagai ‘tidak terdeteksi’ (Harmita 2004). Nilai LOQhitung

ini bila dibandingkan dengan penelitian Oasman dan Chin (2006) (Tabel 12.), jauh lebih baik. Data-data tersebut memiliki nilai RSD yang cukup besar dibandingkan dengan penggunaan instrumen HPLC-ELSD.

Tabel 12. Perbandingan hasil uji LDI dan LOQ penulis dengan Osman dan Chin (2006).

Peneliti Instrumen LDI (µg/mL) LOQhitung (µg/mL)

Penulis HPLC-ELSD 1,07 3,57

Osman dan Chin (2006) Spektrofotometer 14 15

HPLC-UV 0,08 0,60

GC 4,00 13

4.5. Rekoveri dan Ripitabilitas

Rekoveri dilakukan pada tiga konsentrasi spiking yang berbeda yaitu rendah (50 µg/g sampel), sedang (250 µg/g sampel) dan tinggi (3000 µg/g sampel). Hasil uji rekoveri pada analisis kolesterol ditampilkan pada Tabel 13, Tabel 14, dan Tabel 15. Nilai rekoveri ini diperoleh dengan menggunakan persamaan dari kurva linieritas spiking standar pada Lampiran 3, dimana persamaan yang diperoleh adalah y = 35,58x – 3140 dengan nilai R² sebesar 0,997.

Rekoveri menunjukkan keakuratan hasil analisis yang diperoleh adalah 122,13% untuk konsentrasi spiking rendah. Dimana nilai ini tidak sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 5. ialah antara 80 hingga 110%. Untuk rekoveri pada konsentrasi spiking sedang memperoleh keakuratan sebesar 108,23% dan telah sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 5. ialah antara 90 hingga 107%. Uji rekoveri konsentrasi spiking tinggi hanya memperoleh keakuratan sebesar 44,71%, dimana nilai ini berada dibawah AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 5 ialah antara 95

(25)

24

hingga 105%. Adanya perbedaan hasil yang diperoleh dengan nilai perhitungan yang seharusnya didapat (sistematik error). Pengukuran kolesterol dengan menggunakan HPLC-ELSD, hanya dapat dilakukan untuk sampel yang memiliki konsentrasi dibawah 3000 µg/g sampel.

Tabel 13. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike rendah (50 µg/g).

Ulangan Kolesterol yang

Ditambahkan (μg/g)

Jumlah Kolesterol Standar

yang Terbaca (μg/g) Rekoveri (%)

1 50 57,53 115,14

2 50 61,11 122,33

3 50 62,86 125,90

4 50 63,34 126,87

5 50 57,84 115,83

6 50 65,90 131,97

7 50 58,39 116,87

Rata-Rata 60,9957 122,1302

SD 3,21

RSD (%) 5,26

Tabel 12. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike sedang (250 µg/g).

Ulangan Kolesterol yang

Ditambahkan (μg/g)

Jumlah Kolesterol Standar

yang Terbaca (μg/g) Rekoveri (%)

1 250 275,77 109,31

2 250 253,28 100,33

3 250 263,85 104,60

4 250 270,61 107,29

5 250 277,42 110,03

6 250 288,37 114,31

7 250 282,07 111,77

Rata-Rata 273,0542 108,2354

SD 11,72

RSD (%) 4,29

Tabel 13. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike tinggi (3000 µg/g).

Ulangan Kolesterol yang

Ditambahkan (μg/g)

Jumlah Kolesterol Standar

yang Terbaca (μg/g) Rekoveri (%)

1 3000 1569,52 52,58

2 3000 1392,04 46,63

3 3000 1147,45 38,47

4 3000 1341,82 44,97

5 3000 1381,48 46,32

6 3000 1251,98 41,95

7 3000 1253,92 42,06

Rata-Rata 1334,0306 44,7118

SD 134,84

(26)

25

Ripitabilitas ditunjukkan dengan hasil RSD analisis yang diperoleh adalah 5,26% untuk konsentrasi spiking rendah. Dimana nilai ini telah sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 6. adalah maksimal 7,3%. Untuk ripitabilitas pada konsentrasi spiking sedang memperoleh nilai RSD sebesar 4,29% dan telah sesuai dengan AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 6. adalah maksimal 5,3%. Uji ripitabilitas konsentrasi spiking tinggi hanya memperoleh nilai RSD sebesar 10,11%, dimana nilai ini berada diatas AOAC (1993) yang tertera pada Tabel 6 adalah maksimal 3,7%.

Tidak memenuhinya persyaratan uji ripitabilitas pada konsentrasi spiking tinggi, dimungkinkan karena adanya kesalahan acak analisis. Penelitian yang dilakukan oleh Osman dan Chin (2006), pengukuran uji rekoveri hanya dilakukan pada satu konsentrasi spiking yaitu pada konsentrasi 300 µg/mL kolesterol standar. Dengan nilai konsentrasi yang terbaik dicapai pada metode Bohac dengan instrumen HPLC UV-VIS yang mencapai nilai rekoveri 96,67% dengan RSD 7,50%. Hal ini menunjukkan bahwa metode HPLC-ELSD yang telah dilakukan oleh peneliti memiliki nilai rekoveri yang lebih baik yang ditunjukkan dengan nilai RSD yang lebih rendah dari metode yang telah dilakukan oleh Osman dan Chin (2006).

4.6. Method Detection Limit

(MDL)

Uji MDL merupakan kelanjutan dari uji rekoveri dengan memplotkan nilai SD pada setiap konsentrasi kedalam sebuah kurva hubungan antara konsentrasi standar kolesterol yang ditambahkan dengan SD. Hasil uji MDL pada tiga konsentrasi yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 13. Dari hasil persamaan y = 0,042x + 0,741 dengan nilai R2 sama dengan 1, diperoleh SD0 (x = 0) yaitu 0,741 µg/g. Nilai MDL dihitung sebesar tiga kali SD0 ialah 2,30 µg/g, dimana nilai ini lebih rendah dari

LOQhitung (3,57 µg/mL). Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan memiliki tingkat

sensitivitas yang baik karena dapat mendeteksi kolesterol dalam maktriks hingga pada konsentrasi 2,30 µg/g.

Gambar 14. Kurva uji MDL dalam analisis kolesterol menggunakan instrumen HPLC-ELSD.

4.7. Intra Reprodusibilitas

Hasil uji intra reprodusibilitas dapat dilihat pada Tabel 14. Berdasarkan tabel tersebut diketahui bahwa RSD yang dihasilkan adalah 0,04%, nilai ini telah memenuhi batas keterimaannya

y = 0,044x + 0,768 R² = 1

0 20 40 60 80 100 120 140

0 1000 2000 3000

D (

(27)

26

adalah ≤ 5,30%. Hasil ini menunjukkan ba hwa metode yang telah dilakukan memiliki nilai keterulangan yang baik pada selang waktu tertentu. Setelah di uji T, diketahui bahwa andar kedua ulangan tersebut tidak berbeda nyata.

Tabel 14. Hasil uji intra reprodusibilitas analisis kolesterol pada telur dengan HPLC-ELSD. Bulan ke- Hasil analisis (μg/g)* Rata-rata hasil analisi

(μg/g) SD RSD Thitung

1 564,27 562,68 2,25 0,40 0,4079**

2 561,09

Ket: * = rata-rata dari 3 ulangan analisis ** = tidak berbeda nyata

(28)

27 V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Hasil validasi metode analisis kolesterol menggunakan HPLC–ELSD dengan matriks sampel telur yaitu uji linieritas pada rentang 0 – 5000 µg/g sampel menghasilkan R2 sebesar 0,997; LDI dan LoQhitung yang dihasilkan adalah 1,07 µg/mL dan 3,56 µg/mL; hasil uji rekoveri pada konsentrasi spiking rendah (50 µg/g sampel) adalah 122,13%, konsentrasi spiking sedang (250 µg/g sampel) adalah 108,23%, dan konsentrasi spiking tinggi (3000 µg/g sampel) adalah 44,71%; hasil uji ripitabilitas pada konsentrasi spiking rendah (50 µg/g) adalah 5,26%, konsentrasi spiking sedang (250 µg/g) adalah 4,29%, dan konsentrasi spiking tinggi (3000 µg/g ) adalah 10,11%; nilai MDL yang diperoleh adalah 2,30 µg/g; dan hasil uji intra reprodusibilitas adalah 0,04 %.

Berdasarkan hasil tersebut di atas dapat disimpulkan bahwa metode analisis kolesterol menggunakan HPLC–ELSD dengan matriks sampel telur adalah valid untuk konsentrasi kolesterol uji ≤ 3000 µg/g sampel. Metode tersebut dapat digunakan untuk analisis rutin di laboratorium pengujian.

5.2. Saran

Validasi metode perlu dilakukan dengan menggunakan matrik sampel telur yang berasal dari hewan yang berbeda ataupun dengan sumber matriks sampel lainnya seperti daging dan ikan. Pemisahan antar peak belum sempurna, hal ini dapat diatasi dengan menurunkan laju alir fase gerak, sehingga memisahan antar peak akan lebih sempurna.

(29)

VALIDASI METODE ANALISIS KOLESTEROL MENGGUNAKAN

HPLC – ELSD DENGAN MATRIKS SAMPEL TELUR AYAM

SKRIPSI

TIKA SETIANINGRUM

F24084002

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

(30)

28 DAFTAR PUSTAKA

Agullós E., Gelós S. 1996. Gas-liquid chromatographic determination of total and free cholesterol in egg pastas. Bromatology, Department of Chemistry and Chemical Engineering, Universidad National de1 Sur, Avenida Alem 1253, 8000 Bahia Blanca, Argentina.

Almatsir S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama. Anton M. 2007. Bioactive Egg Compounds. Berlin: Springer.

Arifin MB. 2005. Kandungan Lemak, Kolesterol Daging serta Penampilan Ayam Broiler Umur 3 Minggu sampai 8 Minggu yang diberi Makan Daun Katuk (Sauropus androgynus) dalam Ransumnya [skripsi]. Bogor: Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Astawan M. 2008. Telur Asin, Aman dan Penuh Gizi

[26 Desember 2010].

Avalli A., Contarini G. 2005. Determination of phospholipids in dairy products by SPE/HPLC/ELSD. Journal of Chromatography A, 1071: 185-190.

Bender AE., Bender DA. 2001. Food Tables & Labeling. London: Oxford.

Bischoff. 2011. HPLC Analysis.

2011)

Cunha SC., Oliveira MBPP. 2006. Discrimination of vegetable oils by triacylglycerols evaluation of profile using HPLC/ELSD. Journal Food Chemistry, 95: 518-524.

[EMA] The European Agency for the Evaluation of Medical Products. 1995. ICH. Topic Q2B.

Validation of Analytical Procedures: Methodology.

Pharmacontract.ch/support/pdf-support/Q2a.pdf [2 November 2010]

[EURECHEM] Working Group. 1998. The Fitness for Purpose of Analytical Methods –A Laboratory Guide to Methods Validation and related Topics.

Graeve M., Janssen D. 2009. Improved separation and quantification of neutral and polar lipid classes by HPLC-ELSD using a monolithic silica phase: Application to exceptional marine lipids. Journal of Chomatography B, 877: 1815-1819.

Hadi, A.2007. Pemahaman dan Penerapan ISO/IEC 17025:2005. PT Gramedia Pustaka Utama: Jakarta

Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3): 117-135.

Hart H. 2003. Kimia Organik suatu Kuliah Singkat. Jakarta: Erlangga.

Huber L. 2001. Validation of Analytical Methods. www. Labcompliance.com. [8 Oktober 2010] Letter WS. 1992. A Rapid Method for Phospholipid Class Separation by HPLC using an Evaporative

Light-Scattering Detector. Journal of Liquid Chrommatography, 15 (2): 253-266.

Megoulas NC, Koupparis MA. 2005. Development and validation of a novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals, plasma, and urine. Anal Bioanal Chem 382: 290-296.

(31)

29

Min DB., Steenson DF. 1998. Crude Fat Analysis. Di dalam Food Analysis 3rd Editions. SS. Nielsen

(ed). Maryland: Aspen Publisher, Inc.

Meyer LH. 1966. Food Chemistry, 4th ed. New York: Reinhold Publishing Corp.

Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1993. Metabolisme Zat Gizi. Jilid II. Jakarta: Pustaka Sinar Harapan.

Osman H., Chin YK. 2006. Comparative Sensitivities of Cholesterol Analysis using GC, HPLC and Spectrophotometric Methods. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 10 (2): 205-210.

Pasaribu N. 2004. Minyak Buah Kelapa Sawit. Universitas Sumatera Utara, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan.

Rahayu IHS. 2003. Karakteristik Fisik, Komposisi Kimia dan Uji Organoleptik Telur Ayam Merawang dengan Pemberian Pakan Bersuplemen Omega-3. Jurnal Teknologi dan Industri Oangan, XIV (3): 199-205.

Ranganna S. 1979. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Produck. New York: Tata Mc. Graw Hill Publ. Co., Ltd.

[SNI] Standar Nasional Indonesia. 2002. 01-3741-2002 Minyak Goreng. Badan Standar Nasional. Soeka YS., Sulistyo J., Naiola E. 2008 Analisis Biokimia Minyak Kelapa Hasil Ekstraksi Secara

Fermentasi. BIODIVERSITAS, 9(2): 91-95.

USDA. 2011. Cholesterol High Avoid. http: www.dietaryfiberfood.com/cholesterol_high_avoid.php . [10 Feb 2011].

Wardiny TM. 2006.Kandungan Vitamin A, C dan Kolesterol Telur Ayam yang Diberi Mengkudu (Morindra citrifolia) dalam Ransum [tesis]. Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

(32)

VALIDASI METODE ANALISIS KOLESTEROL MENGGUNAKAN

HPLC – ELSD DENGAN MATRIKS SAMPEL TELUR AYAM

SKRIPSI

TIKA SETIANINGRUM

F24084002

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

(33)

METHOD VALIDATION OF CHOLESTEROL ANALYSIS USING HPLC - ELSD ON EGG AS SAMPLE MATRIX

Tika Setianingrum and Hanifah Nuryani Lioe

Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO BOX 220, Bogor, West Java, Indonesia

Phone: +62 813 15830421, E-mail: tika_sn@yahoo.com

ABSTRACT

(34)

TIKA SETIANINGRUM. F24084002. Validasi Metode Analisis Kolesterol Menggunakan HPLC

– ELSD Dengan Matriks Sampel Telur. Dibawah bimbingan Hanifah Nuryani Lioe. 2011.

RINGKASAN

Kolesterol merupakan jenis steroid yang paling dikenal. Dengan 27 karbon, kolesterol dibiosintesis dari lanosterol. Keberadaan kolesterol hanya ditemukan pada pangan yang berasal dari hewani. Informasi mengenai kadar kolesterol dari berbagai bahan pangan yang dikonsumsi setiap harinya sangat penting untuk diketahui mengingat setiap jenis bahan pangan memiliki kandungan kolesterol yang berbeda-beda. Kadar kolesterol di dalam bahan pangan dapat diukur dengan berbagai

metode. Menurut Letter (1992), HPLC-ELSD dapat digunakan untuk mengklasifikasikan

phospholipid (kolesterol, fosfatidiletanolamin, fosfatidilcerin, fosfatidikolin dan spingomielin) pada konsentrasi 350 µg/µL

Proses validasi metode dilakukan dengan mengukur uji kesesuaian sistem, spesifisitas, linieritas metode, limit deteksi instrumen (LDI), rekoveri dan ripitabilitas, method detection limit

(MDL), dan intra reprodusibilitas. Sampel kolesterol dalam matrik telur mengalami ektraksi menggunakan asam (HCl 4:1) dan saponifikasi menggunakan KOH 2%. Kemudian akan di injeksikan kedalam instrumen HPLC-ELSD pada kondisi fase gerak berupa heksan: 2-propanol (90:10), kolom silica (25 cm x i.d. 4,6 cm dengan ukuran partikel 10µm), laju alir 2 mL/menit, suhu 50 ºC, detektor ELSD (Sedex 55) dengan tekanan gas N2 sebesar2,2 bar, Gain 7, volume injeksi 20 µL.

konsentrasi spiking rendah (50 µg/g) adalah 122,12%, konsentrasi spiking sedang (250 µg/g) adalah 108,23%, dan konsentrasi spiking tinggi (3000 µg/g ) adalah 44,71%; hasil uji repeatability pada konsentrasi spiking rendah (50 µg/g) adalah 5,26%, konsentrasi spiking sedang (250 µg/g) adalah 4,29%, dan konsentrasi spiking tinggi (3000 µg/g ) adalah 10,11%; nilai MDL yang diperoleh adalah 2,30 µg/g; dan hasil uji intra reprodusibilitasadalah 0,04%.

(35)

VALIDASI METODE ANALISIS KOLESTEROL MENGGUNAKAN HPLC – ELSD DENGAN MATRIKS SAMPEL TELUR AYAM

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,

Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor

Oleh

TIKA SETIANINGRUM F24084002

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2011

(36)

Judul Skripsi : VALIDASI METODE ANALISIS KOLESTEROL MENGGUNAKAN HPLC – ELSD DENGAN MATRIKS SAMPEL TELUR AYAM

Nama : Tika Setianingrum

NIM : F24084002

Menyetujui: Pembimbing,

NIP. 19680809 199702 2 001 Dr. Ir. Hanifah N. Lioe, M.Si.

Mengetahui:

Plt. Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,

NIP. 19610802 198703 2 002 (Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, M.Si)

(37)

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Validasi Metode

Analisis Kolesterol Menggunakan HPLC – ELSD Dengan Matriks Sampel Telur Ayam adalah

hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, September 2011 Yang membuat pernyataan

F24084002 Tika Setianingrum

(38)

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari

Institut Pertanian Bogor, sebagaian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, microfilm, dan sebagainya.

(39)

BIODATA PENULIS

Tika Setianingrum lahir Bogor, 27 Desember 1983 dari

pasangan ayah H. Rasid dan ibu Hj. Jajah Darjati, sebagai anak ke

empat dari empat bersaudara. Penulis menamatkan D3 pada tahun

2005 dari program studi Supervisor Jaminan Mutu Pangan - IPB

dan pada tahun 2008 diterima di IPB melalui jalur reguler. Penulis

memilih Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Departemen

Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian.

Sebelumnya penulis pernah bekerja di beberapa perusahaan seperti

PT. Indoprima Foods, PT Belfoods Indonesia dan PT. Sorin Maharasa. Bekerja pada

departemen Quality Assurance (QA) sejak 2006 hingga 2009.

(40)

i

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur dipanjatkan ke hadapan Allah SWT atas karuniaNya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul Validasi Metode Analisis Kolesterol Menggunakan HPLC – ELSD dengan Matriks Sampel Telur, yang dilaksanakan di Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan sejak bulan Maret sampai Agustus 2011.

Dengan telah selesainya penelitian hingga tersusunnya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Dr. Ir. Hanifah N. Lioe, M.Si. selaku pembimbing akademik yang telah bersedia memberikan waktu dan perhatian serta bimbingan yang peniuh dengan kesabaran kepada penulis sejak perkuliahan dimulai hingga skripsi ini selesai.

2. Dr. Didah Nur Faridah, S.Tp., M.Sc. dan Azis Boing S., S.Tp., M.Sc. selaku dosen penguji yang telah bersedia meluangkan waktu dan membagi ilmu kepada penulis.

3. Segenap staff LJA atas segala bantuan dan juga bimbingan selama penelitian berlangsung sehingga penelitian dapat berjalan dengan lancar.

4. Seluruh staf dan dosen Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan atas bimbingan, kerjasama, serta kepercayaan selama penulis menyelesaikan studinya.

5. Orang tua dan keluarga, yang telah memberi banyak bantuan dan kasih sayang.

6. Ibu Elmiati dan Mb. Muslikatin, sebagai teman seperjuangan, membantu dalam segala kesulitan, semoga kekompakan akan selalu menjadi milik kita.

7. Zul Aswardi, sebagai teman yang akan terus mendampingi penulis.

Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan memberikan kontribusi yang nyata terhadap perkembangan ilmu pengetahuan di bidang Teknologi Pangan. Wassalam.

Bogor, September 2011 Tika Setianingrum

(41)

DAFTAR ISI

Halaman KATA PENGANTAR ... i DAFTAR ISI ... ii DAFTAR TABEL ... iii DAFTAR GAMBAR ... iv DAFTAR LAMPIRAN ... v I. PENDAHULUAN ... 1 1.1. Latar Belakang ... 1 1.2. Tujuan dan Manfaat Penelitian ... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA ... 3 2.1. Kolesterol ... 3 2.2. Kandungan Kolesterol dalam Telur dan Analisisnya ... 5 2.3. Analisis dengan Menggunakan HPLC-ELSD ... 7 2.4. Validasi Metode Analisis ... 10 III. METODE PENELITIAN ... 14 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ... 14 3.2. Bahan dan Alat ... 14 3.3. Metode Penelitian ... 14 3.3.1. Pemilihan dan persiapan sampel ... 14 3.3.2. Uji Kesesuaian sistem ... 14 3.3.3. Spesifisitas ... 15 3.3.4. Linieritas metode... 15 3.3.5. Limit Deteksi Instrumen ... 15 3.3.6. Akurasi dan Presisi... 16 3.3.7. MDL (Method Detection Limit) ... 16 3.3.8. Intra Reprodusibilitas ... 16 3.4. Prosedur Analisis Kolesterol ... 17 3.4.1. Persiapan larutan standar kolesterol ... 17 3.4.2. Persiapan sampel pada matriks telur (AOAC 976.26) ... 17 3.4.3. Pengukuran dengan HPLC-ELSD ... 18 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 19 4.1. Uji Kesesuaian Sistem ... 19 4.2. Spesifisitas... 19 4.3. Linieritas Metode ... 21 4.4. Limit Deteksi Instrumen ... 22 4.5. Rekoveri dan Repeatabilitas ... 23 4.6. Method Detection Limt (MDL) ... 25 4.7. Intra Reprodusibilitas ... 25 V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 37 DAFTAR PUSTAKA ... 28 LAMPIRAN ... 30

(42)

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Kandungan kolesterol pada beberapa produk pangan. ... 4 Tabel 2. Hasil uji rekoverikolesterol pada sampel matrik miyak sawit. ... 4 Tabel 3. Tingkat sensitifitas instrumen terhadap kandungan kolesterol pada sampel (Osman

dan Chin 2006). ... 4 Tabel 4. Komposisi kimia telur ayam ... 5 Tabel 5. Kandungan kolesterol dalam telur dan produknya ... 6 Tabel 6. pengujian kalasifikasi steroid menggunakan HPLC-UV dan HPLC-ELSD. ... 9 Tabel 7. Keterimaan persen RSD untuk uji ripitabilitas ... 11 Tabel 8. Keterimaan persen rekoveri ... 12 Tabel 9. Hasil uji kesesuian sistem analisis kolesterol menggunakan instrumen

HPLC–ELSD ... 19 Tabel 10. Perbandingan hasil uji linieritas penulis dengan penelitian Osman dan Chin

(2006) ... 22 Tabel 11. Hasil pengukuran LDI* pada konsentrasi kolesterol 50 μg/mL ... 23 Tabel 12. Perbandingan hasil uji LDI dan LOQ penulis dengan Osman dan Chin (2006). ... 23 Tabel 13. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike rendah (50 µg/g) ... 24 Tabel 14. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike sedang (250 µg/g) ... 24 Tabel 15. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike tinggi (3000 µg/g) ... 24 Tabel 16. Hasil uji intra reprodusibilitas analisis kolesterol pada telur dengan

(43)

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Struktur kolesterol (a) dan fitosterol (b) (Hart 2003) ... 3 Gambar 2. Skema keterikatan kolesterol dalam matriks kuning telur telur (Anton 2007). .... 6 Gambar 3. Klasifikasi phospholipid dalam kuning telur kering dengan menggunakan

HPLC - ELSD (1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilkolin dan 4. spingomielin) ... 7 Gambar 4. Komponen standar HPLC ... 7 Gambar 5. Tahapan proses HPLC-ELSD ... 8 Gambar 6. Perbandingan hasil pengukuran konsentrasi steroid dengan menggunakan HPLC- UV dan HPLC-ELSD ... 9 Gambar 7. Kromatogramdari 6 klasifikasi phospholipid standar yang di injeksikan kedalam

HPLC-ELSD (1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilserin, 4. fosfatidilkolin dan 5. spingomielin) yang masing-masing sebanyak

350µg/µL ... 10 Gambar 8. Metode validasi ... 11 Gambar 9. Hasil injeksi standar kolesterol 1014 µg/mL. ... 20 Gambar 10. Hasil injeksi sampel tanpa penambahan kolesterol standar ... 20 Gambar 11. Hasil injeksi sampel yang ditambahkan kolesterol standar 507 µg/g ... 21 Gambar 12. Kurva linieritas metode analisis kolesterol dengan penambahan adisi standar

menggunakan HPLC-ELSD ... 21 Gambar 13. Kurva standar kolesterol 10,14 – 1014,00 (μg/mL) tanpa menggunakan matriks

telur ayam ... 22 Gambar 14. Kurva uji MDL dalam analisis kolesterol menggunakan instrumen

(44)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Tabel Hasil Uji Linieritas Metode ... 31 Lampiran 2. A. Data kurva kalibrasi standar kolesterol tanpa maktriks telur

ayam ... 32 B. Data kurva kalibrasi standar kolesterol dengan maktriks telur

Ayam ... 32 Lampiran 3. Tabel Hasil Uji Rekoveri ... 33 Lampiran 4. Gambar Hasil Pengukuran Linieritas Standar Kolesterol 10,14 – 1014 µg/mL . 34 Lampiran 5. Gambar Hasil Uji Kesesuaian Sistem pada Konsentrasi 50 µg/mL Kolesterol

Standar ... .36 Lampiran 6. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike rendah (50 µg/g) ... 38 Lampiran 7. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike sedang (250 µg/g) ... 40 Lampiran 8. Hasil uji rekoveri pada konsentrasi spike tinggi (3000 µg/g) ... 42 Lampiran 9. Hasil uji Linieritas Metode Ulangan 1 ... 44 Lampiran 10.Hasil uji Linieritas Metode Ulangan 2 ... 46 Lampiran 11.Hasil uji Linieritas Metode Ulangan 3 ... 48 Lampiran 12.Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ... 50 Lampiran 13.Hasil uji intra repetabilitas kolesterol pada matriks telur... 52 Lampiran 14.Simulasi perhitungan pada uji rekoveri ... 53

(45)

1 I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

(46)

2

1.2. Tujuan dan Manfaat Penelitian

(47)

3 II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kolesterol

(a.)

(b.)

Gambar 1. Struktur kolesterol (a) dan fitosterol (b) (Hart 2003).

(48)

4

Tabel 1. Kandungan kolesterol pada beberapa produk pangan.

Jenis Pangan Jumlah kandungan kolesterol (mg/100g)

Produk daging sapi 57 – 100

Keju cheddar 100

Produk daging ayam 38 – 103

Produk ikan 42 – 70

Buah apel 0

Blackberries 0

Beras 0

Minyak babati 0

Sumber: Bender (2001).

Tabel 2. Hasil uji rekoverikolesterol pada sampel matrik miyak sawit.

Instrumen Cara Ekstraksi

Konsentrasi kolesterol sebenarnya (mg/mL) * Konsentrasi kolesterol yang terdeteksi (mg/mL) RSD (%) Rekoveri (%) Spektrofotometer UV-VIS

- Bohac 0,3 0,26 6,66 86,67

- Beyer dan Jensen 0,3 0,11 18,17 36,67

- Queensland SE. 0,3 0,38 18,42 126,67

HPLC-UV detector

- Bohac 0,3 0,29 7,50 96,67

- Beyer dan Jensen 0,3 0,22 9,10 73,33

- Queensland SE 0,3 0,33 9,56 110

Gas

Chromatography

- Bohac 0,3 0,25 28,57 83,33

- Beyer dan Jensen 0,3 0,18 51,23 60,00

- Queensland SE 0,3 0,44 34,38 146,67

Keterangan: * = rata-rata dari 8 kali ekstraksi. Sumber: Osman, Chin (2006).

(49)

5

Tabel 3. Tingkat sensitifitas instrumen terhadap kandungan kolesterol pada sampel (Osman dan

Chin 2006). Instrumen Kandungan kolestrol sebenarnya (mg) Ketepatan * LOD (μg/mL)

LOQ (µg/mL) Pengukuran (mg) RSD (%)

Spektrofotometer UV-VIS 0,27 0,203 ± 0,032 5,76 13 15

HPLC UV detector 0,27 0,263 ± 0,013 4,94 0,08 0,60

Gas Chromatography 0,27 0,202 ±0,048 23,76 4,00 13

Keterangan * n = 8

2.2. Kandungan Kolesterol dalam Telur dan Analisisnya

Tabel 4. Komposisi kimia telur ayam.

Komponen Putih Telur Kuning Telur Telur Utuh

Kadar air (g/100g) 88,3 51 75,1

Protein (g/100g) 9,0 16,1 12,5

Lemak (g/100g) 0,0 30,5 10,8

Karbohidrat (g/100g) 0,0 0,0 0,0

Kalori (kj/100g) 151 1419 615

Kolesterol (mg/100g) 0,0 1120 385

Keterangan : - = tidak dianalisis. Sumber: Bender (2001).

(50)

6

Tabel 5. Kandungan kolesterol dalam telur dan produknya.

No. Sumber kolesterol dalam makanan Kandungan kolesterol

dalam mg/ 100 g produk

1 Telur ayam, kuning telur, kering 2335,00

2 Telur ayam, utuh, kering, 2017,00

3 Telur ayam, utuh, kering 1715,00

4 Telur ayam, kuning telur, mentah, segar 1234,00

5 Telur ayam, kuning telur, mentah, beku 1075,00

6 Telur ayam, kuning telur, mentah, beku, ditambah gula 959,00

7 Telur ayam, kuning telur, mentah, beku, ditambah garam 955,00

8 Telur, kalkun, utuh, segar, mentah 933,00

9 Telur, bebek, utuh, segar, mentah 884,00

10 Telur, angsa, utuh, segar, mentah 852,00

11 Telur, puyuh, utuh, segar, mentah 844,00

12 Telur ayam sustitusi, bubuk 572,00

13 Telur ayam, utuh, masak, goreng 457,00

14 Telur ayam, utuh, mentah, beku 432,00

15 McDONALD'S, Telur ayam acak 427,00

16 Fast foods, telur ayam, acak 426,00

17 Telur ayam, utuh, masak, rebus matang 424,00

18 Telur ayam, utuh, mentah, segar 423,00

19 Telur ayam, utuh, masak, kukus tanpa kulit 422,00

20 Telur ayam, utuh, masak, omelet 356,00

21 Telur ayam, utuh, masak, acak 352,00

Sumber: USDA (2011).

Gambar 2. Skema keterikatan kolesterol dalam matriks kuning telur (Anton 2007).

(1)

48

Gambar. Hasil ujilinieritas pada konsentrasi spike 0 mg/mL. Gambar. Hasil ujilinieritas pada konsentrasi spike 100 mg/mL.

Gambar. Hasil ujilinieritas pada konsentrasi spike 250 mg/mL. Gambar. Hasil ujilinieritas pada konsentrasi spike 500 mg/mL.

(2)

49 Lampiran 11. (Lanjutan).

(3)

50

Gambar. Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ulangan 1. Gambar. Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ulangan 2.

Gambar. Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ulangan 3. Gambar. Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ulangan 4.

(4)

51 Lampiran 12. (Lanjutan).

Gambar. Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ulangan 7. Gambar. Hasil pengukuran kolesterol pada matriks telur ulangan 8.

(5)

52

Gambar. Hasil uji intra ripitabilitaskolesterol pada matriks telur ulangan 1. Gambar. Hasil uji intra ripitabilitaskolesterol pada matriks telur ulangan 2.

Gambar. Hasil uji intra ripitabilitaskolesterol pada matriks telur ulangan 3. Gambar. Hasil uji intra ripitabilitaskolesterol pada matriks telur ulangan 4.