10
Gambar 7. Kromatogram dari 6 klasifikasi phospholipid standar yang di injeksikan kedalam
HPLC-ELSD 1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilserin, 4. fosfatidilkolin dan 5. spingomielin yang masing-masing sebanyak 350µgµL.
2.4. Validasi Metode Analisis
Validasi metode menurut JECFA 2006, direkomendasikan untuk memastikan bahwa suatu metode dapat menghasilkan data yang akurat dan dapat dipercaya. Validasi dipergunakan untuk
metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Selain itu, validasi metode dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat validasi metode terdahulu, atau terjadi
perubahan metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi metode analisis yaitu untuk mengevaluasi unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan
dan kedapat ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul.
Validasi metode dilakukan dengan cara melakukan Ketelitian precision, akurasi accuracy, batas deteksi atau limit of detection LOD, batas kuantitatif atau limit of quantitation LOQ,
selektivitas specificity, linieritas, ketangguhan ruggedness, uji kekuatan robustness dan kesesuaian sistem Gambar 8. Terdapat beberapa rujukan validasi metode seperti United State
Pharmacopoeia USP, British Pharmacopoeia BP, Association of Official Analytical Chemistry AOAC, International Union of Pure and Applied Chemistry IUPAC dan International Conference
on Harmonizaton ICH. Penelitian ini mengacu pada petunjuk validasi dari JECFA 2006, meliputi pengujian presisi, akurasi, LOD, batas penentuan Limit Of Determination, linieritas, rekoveri, dan
sensitifitas.
1
2 3
4 5
11
Gambar 8. Metode validasi. Uji ketelitian presisi digunakan untuk mengevaluasi tingkat kedekatan antara hasil tes
individu sampel tertentu sehingga diketahui kesalahan acak analisis Harmita 2004. Uji ketelitian tidak berhubungan dengan nilai benar atau tidaknya nilai tersebut. Ukuran ketelitian biasanya
dinyatakan dalam ketidaktepatan dan dihitung sebagai RSD dari hasil uji. Uji ketelitian dapat berupa uji keterulangan ripitabilitas dan ketertiruan reprodusibilitas.
Uji ripitabilitas adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi yang sama dan dalam interval waktu yang pendek Harmita 2004. Ripitabilitas
dilakukan dengan menggunakan sampel yang identik dari batch yang sama, sehingga dapat memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Persen ripitabilitas yang dapat diterima,
dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7. Keterimaan persen RSD untuk uji ripitabilitas.
Analat Unit
RSD 100
100 1,3
10 10
2,8 1
1 2,7
0,1 0,10
3,7 0,01
100 ppm 5,3
0,001 10 ppm
7,3 0,0001
1 ppm 11
0,00001 100 ppb
15 0,000001
10 ppb 21
0,0000001 1 ppb
30 0,00000001
0,1 ppb 43
Sumber: AOAC 1993. Reprodusibilitas adalah keseksamaan metode yang dikerjakan pada kondisi berbeda. Analisis
dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik serta
Metode validasi
Ketelitian Akurasi
Batas deteksi Batas Kuantitatif
Selektivitas Linieritas
Ketangguhan Uji kekuatan
Kesesuaian Sistem
12
dari batch yang sama. Reprodusibilitas dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda. Percobaan ketelitian dilakukan terhadap
paling sedikit tujuh replika sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen AOAC 1993.
Akurasi adalah kemampuan suatu alat ukur untuk memberikan respon yang dekat dengan nilai sebenarnya Harmita 2004. Akurasi juga dinyatakan sebagai persen perolehan kembali rekoveri
analit yang ditambahkan. Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi spiked- placebo recovery atau metode adisi standard addition method.
Metode simulasi dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit bahan murni ke dalam plasebo semua campuran reagent yang digunakan minus analit, lalu campuran tersebut dianalisis
dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan kadar yang sebenarnya. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo, maka dapat dipakai metode adisi. Dalam metode
adisi, sampel dianalisis untuk diketahui komposisi awal analitnya, kemudian sampel ditambahkan sejumlah tertentu standar dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang
sebenarnya hasil yang ditambahkan. Hasil uji rekoveri dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang
sebenarnya, sehingga akan diketahui nilai analisis error sistematisnya. Analisis dilakukan pada kondisi yang sama antara sampel dan sampel yang ditambahkan standar. Kesalahan sistematis adalah sama
dengan minus kesalahan acak dan penyebab dari kesalahan ini tidaklah diketahui. Persen rekoveri yang dapat diterima dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8. Keterimaan persen rekoveri. Analat
Unit Rata-Rata Rekoveri
100 100
98 – 102 10
10 98 – 102
1 1
97 – 103 0,1
0,10 95 – 105
0,01 100 ppm
90 – 107 0,001
10 ppm 80 – 110
0,0001 1 ppm
80 – 110 0,00001
100 ppb 80 – 110
0,000001 10 ppb
60 – 150 0,0000001
1 ppb 40 – 120
Sumber: AOAC 1993. Uji Limit of Detection LOD merupakan konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat
dideteksi dan memberikan respon yang signifikan oleh alat Harmita 2004, tetapi konsentrasi tersebut belum tentu dimiliki oleh sampel yang diujikan. Menurut AOAC 1993, LOD disebut juga
Instrument Detection Limit IDL atau Limit Deteksi Instrumen LDI. Pengujian LDI dilakukan dengan 7 kali ulangan, kemudian dihitung standar deviasinya. LDI, dinyatakan oleh persamaan:
Keterangan: LDI
= Limit Deteksi Instrumen x
= rata-rata hasil pembacaan blanko sampel SD
= standar deviasi
13
Uji Limit of Quantitation LOQ menurut Harmita 2004 adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurat dan presisi. Harmita 2004 menyatakan bahwa
prinsip uji LOQ pada metode yang menggunakan instrumen dilakukan dengan membuat sederet blanko contoh sebanyak 7 – 10 kali ulangan. LOQ dinyatakan oleh persamaan:
Keterangan: LOQ = Limit of Quantitation
SD = standar deviasi
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu secara akurat dan presisi walaupun terdapat komponen lain yang mungkin ada dalam matriks
sampel Harmita 2004. Selektivitas dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode terhadap sampel yang mengandung cemaran seperti hasil urai atau senyawa sejenis atau senyawa asing lainnya,
kemudian dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung cemaran. Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang
mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, atau senyawa asing lainnya. Uji selektivitas dapat pula ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai
dengan metode yang hendak digunakan lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivita
Linieritas mendefinisikan kemampuan metode untuk mendapatkan hasil uji proporsi dengan konsentrasi analit. Batas linier merupakan kisaran konsentrasi analit dimana metode yang memberikan
hasil tes proporsional terhadap konsentrasi analit dan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linieritas yang dapat diterima. Jika terdapat hubungan yang linear, hasil uji harus
dievaluasi lebih lanjut secara statistik dengan perhitungan garis regresi. Dalam penentuan linieritas, direkomendasikan untuk menggunakan minimum lima konsentrasi EMA 1995.
Perlakuan matematik dalam pengujian linieritas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam praktek, digunakan
satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 – 150 kadar analit dalam sampel. Linieritas yang baik adalah R
2
lebih dari 0,99 EMA 1995. Ketangguhan metode ruggedness adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari
analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai
tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboraturium dan antar analis.
Uji kekuatan Robustness dilakukan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan metodologi yang kecil yang terjadi terus menerus. Uji kekuatan juga berfungsi untuk mengevaluasi respon analitik
dan efek presisi dan akurasi. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah.
14
III. METODE PENELITIAN
