Analisis Dengan Menggunakan HPLC – ELSD

7 kuning telur kering adalah 1,50 mgmL yang dianalisis menggunakan HPLC-ELSD. Berikut adalah hasil analisis kuning telur kering dengan menggunakan instrumen HPLC-ELSD Gambar 3. Gambar 3. Klasifikasi phospholipid dalam kuning telur kering dengan menggunakan HPLC - ELSD 1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilkolin dan 4. spingomielin.

2.3. Analisis Dengan Menggunakan HPLC – ELSD

HPLC adalah instrumen yang sering digunakan untuk mengindentifikasi komponen pangan. Komponen yang diidentifikasi dengan HPLC harus larut dalam pelarut yang juga berperan sebagai fase gerak. Dengan adanya interaksi komponen dengan fase diam menyebabkan komponen akan keluar dengan waktu retensi yang berbeda. Komponen standar dari HPLC adalah gradien controller, pompasistem dampning, sampel introduction, columnprecolumn, detektor, dan data hasil Gambar 4.. Gambar 4. Komponen standar HPLC. a b c d f e Keterangan: a = pengontrol laju fase gerak d = kolom b = pompa e = detektor c = sempel injektor f = data output 8 Terdapat berbagai jenis detektor yang dapat digunakan pada instrumen HPLC seperti UV-VIS, RI, dan ELSD. Detektor UV-Vis memiliki sensitivitas yang bagus, dan juga paling seletid terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh. Detektor RI merupakan detektor yang bersifat universal setelah detektor UV-VIS, memiliki tingkat sensitivitas yang lebih rendah dari detektor UV- VIS, dan dangat sensitif terhadap perubahan suhu sekitar. Detektor RI tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Menurut Megoulas dan Koupparis 2005, HPLC-ELSD adalah suatu detektor universal, yang mempunyai tingkat selektivitas rendah dan dapat digunakan untuk menganalisis sampel yang memiliki matrik kompleks. HPLC-ELSD telah digunakan untuk mengklasifikasikan phospholipid pada konsentrasi 350µgµL Letter 1992. Penentuan kolesterol dianggap penting karena korelasi yang erat terhadap terjadinya penyakit jantung koroner. Metode analisis kolesterol sebelumnya sangat bergantung pada metode spektroskopi dan gravimetri. Metode spektrofotometer didasarkan pada pengukuran secara enzimatik dan digunakan untuk analisis kolesterol dalam darah, sehingga tidak cocok untuk diaplikasikan pada sampel makanan. Metode kromatografi lebih handal, selektif, dan akurat karena gangguan dari sterol lainnya dapat dihindari. Menurut Graeve dan Janssen 2009, diketahui bahwa HLPC-ELSD dengan kolom silika mampu memisahkan 16 kelas lipid. Terdapat tiga tahapan proses dalam pengoperasian HPLC-ELSD yaitu Nebulization, Evaporation dan Detection Megoulas, Koupparis 2005 Gambar 5.. Tahap nebulization adalah ketika kolom eluen melalui sebuah jarum dan bercampur dengan gas nitrogen dan membentuk dispersi droplets. Tahap kedua adalah tahap evaporation, droplet melewati pemanas driff tube dimana fase bergeraknya terevaporasi. Tahap ketiga adalah tahap detection, partikel sampel melewati sebuah sell dan mengenai cahaya laser beam yang menyebar. Adanya deteksi cahaya tersebut akan memberikan sinyal. Gambar 5. Tahapan proses HPLC-ELSD. Penggunaan instrumen HPLC-ELSD diantaranya memiliki sensitivitas yang cukup baik dibandingkan dengan HPLC-UV. Berikut ini adalah contoh perbandingan hasil pengukuran steroid pada konsenstrasi yang sama dengan menggunakan alat HPLC-UV dengan HPLC-ELSD Gambar 6. Hasil pada Gambar 6. menunjukkan tinggi masing-masing puncak pada HPLC-ELSD lebih besar dibandingkan tinggi puncak pada hasil HPLC-UV, selain itu signal per noise ratio pada HPLC-ELSD terlihat lebih besar daripada HPLC-UV. Menurut Cunha dan Oliveira 2006, menyatakan bahwa HLPC-ELSD memiliki respon yang tidak linier pada konsentrasi sampel yang sangat rendah ataupun sangat tinggi. 9 Gambar 6. Perbandingan hasil pengukuran konsentrasi steroid dengan menggunakan HPLC-UV dan HPLC-ELSD. Kondisi pengujian pada Gambar 6. dapat dilihat pada Tabel 6. berikut. Tabel 6. Kondisi pengujian kalasifikasi steroid menggunakan HPLC-UV dan HPLC-ELSD. Kondisi Instrumen HPLC-UV HPLC-ELSD Kolom ProntoSIL 120-3-C18 H ProntoSIL 120-3-C18 H Eluent MeOH MeOH Laju Alir 0,65 0,65 Detektor UV 200 nm ELSD PMT gain, T = 40 ºC Suhu 30 ºC 30 ºC Jumlah larutan yang di injeksikan 5 µL 5 µL Konsentrasi masing – masing 70 ppm 70 ppm Sumber : anonim 2011. Menurut Letter 1992, HPLC-ELSD juga mampu mengidentifikasi jenis-jenis sterol dengan jelas pada konsentrasi 350 µgµL. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7 berikut. Kolesterol muncul di peak no 1 dengan waktu retensi kurang dari 2 menit. Keterangan Sampel: 1: hydrocortisone 2: progesterone 3: cholecalciferol 4: ergocalciferol 5: ergosterol 6: kolesterol 10 Gambar 7. Kromatogram dari 6 klasifikasi phospholipid standar yang di injeksikan kedalam HPLC-ELSD 1. kolesterol, 2. fosfatidiletanolamin, 3. fosfatidilserin, 4. fosfatidilkolin dan 5. spingomielin yang masing-masing sebanyak 350µgµL.

2.4. Validasi Metode Analisis