2.5.2. Reaksi Rantai Polomerasu PCR
Amplifikasi dilakukan pada lokus mtDNA control region menggunakan primer forward CRK
5’-AGCTC AGCGC CAGAG CGCCG GTCTT GTAAA-3’ dan primer reverse CRE
5’-CCTGA AGTAG GAACC AGATG-3’Lee et al 1995. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 25 µL, menggunakan template DNA sebanyak 1 µ L. Dalam
setiap reaksi terdapat 2,5 µL 10x PCR buffer Applied Biosystems, 2.5 µL 10 mM dNTPs, 1.25 µL pada masing-masing primer 10 mM, 2 µL 25 mM MgCl2 solution,
0.125 µL AmplyTaq Red ™ Applied Biosystems, 1 µL 1x BSA dan 13.5 µL ddH2O.
Profil PCR meliputi denaturasi awal pada suhu 94 °C selama 15 detik, denaturasi pada 94 °C selama 30 detik, annealing pada 50 °C selama 30 detik, dan extension pada 72 °C
selama 45 detik, selama 72 °C untuk 5 menit dan proses ini terjadi pengulangan sebanyak 38 siklus.
2.5.3. Elektroforesis
Elektrofores merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan dan purifikasi DNA. Selain itu elektroforesis bermanfaat untuk bisa melihat
keberhasilan PCR melalui gel agarose 1 dengan cara 1 gram agarosa dimasukkan erlenmeyer kemudian ditambahkan 100 mL TAE 1X. Setelah itu dipanaskan di dalam
mikrowave, jika sudah larut merata ditambahkan 4 uL EtBr. Gel agarosa dituangkan di cetakan yang sudah dipasang sisir pembuat sumur dan didiamkan selama 30 menit. Hasil
elektroforesis kemudian di visualisasi menggunakan mesin ultraviolet dengan voltase 200 V dan arus 400 mA selama 30 menit.
2.5.4. DNA Sekuensing
Hasil PCR yang telah berhasil diamplifikasi kemudian dikirim ke Berkeley Sequencing Facility
USA dengan menggunakan metode Sanger et al 1977 untuk mendapatkan urutan pasang basah sekuen nukleotida.
2.6. Analisis Data
Analisis data dilakukan di laboratorium Indonesia Biodiversity Research Center IBRC, Bali dan laboratorium Marine Biodiversity dan Biosystymatics Ilmu Dan
Teknologi Kelautan, IPB. Sekuen control region mtDNA dianalisis menggunakan empat aplikasi yaitu MEGA5 Molecular Evolutionary Genetic Analysis Tamura et al 2011,
Arlequin 3.5 Excoffier dan Lischer 2009, DnaSP 4.0 Rozas et al 2003 dan Network 4.6.
2.6.1. Identifikasi Spesies
Proses identifikasi ikan tuna begitu sulit dikarenakan rusaknya karakter morfologi setelah ditangkap dan diawetkan dalam waktu yang lama dan bentuk morfologi yang
mirip akibat kedekatan genetik antar individu cukup tinggi, untuk itu diperlukan suatu pendekatan agar dapat memastikan individu yang ditemukan dengan menggunakan
aplikasi MEGA5 Tamura et al 2011. Pada software ini dilakukan proses penjajaran sekuen agar dapat melihat kemiripan yang nyata antar sekuens dengan metode DNA
Weight Matrix ClustalW 1.6 dan Translation Weight 0.5. Identifikasi spesies melalui aplikasi Blast Basic Local Aligment Tools yang tersedia pada program MEGA5.
2.6.2. Analisis Keragaman Genetik dan Struktur Populasi
Analisis keragaman genetik dan struktur populasi melibatkan tingkat keragaman genetik pada data sekuens mtDNA control region menggunakan aplikasi DnaSP 4.0
Rozas et al 2003. Deskripsi analisis statistik DnaSP 4.0 yaitu pengukuran keragaman haplotipe H
d
Nei 1987 dan keragaman nukleotida π Lynch and Crease 1990.
Analisis struktur populasi menggunakan aplikasi Arlequin 3.5 Excoffier dan Lischer 2009 dengan deskripsi level jarak antar populasi dilakukan menggunakan fixation index
Fst Excoffier et al 1992. Jarak genetik dalam dan antar populasi dianalisa berdasarkan parameter jarak Nei 1972 dan Nei 1978, dilakukan menggunakan
MEGA5 Tamura et al 2011. Distribusi haplotipe dan pohon antara sekuens menggunakan aplikasi Network 4.6. Jaringan haplotype berdasarkan jarak berpasangan
antara haplotipe yang dihasilkan menggunakan Arlequin. Secara statistik rumus perhitungan keragaman genetik, struktur populasi dan jarak genetik disajikan dibawah
ini :
Analisis keragaman genetik :
Dimana : h = keragaman genetik n = Jumlah dari grup
Xi = Frekuensi haplotipe sampel - i
Analisis jarak genetik :
Dimana : D = Jarak genetik J
ab
= Frekuensi haplotipe tiap lokasi pada populasi yang sama. J
a
J
b
= Frekuensi haplotipe populasi A dan B Analisis fiksasi indeks Fst :
Dimana : Fst = indeks diferensiasi H
w
= Rata-rata perbedaan intra populasi H
b
= Rata-rata perbedaan diantara populasi Data berupa sekuen mtDNA control region untuk perbandingan genetik ikan sirip
kuning Thunnus albacares dari Hindia diambil sebanyak 20 individu. Semua data diunduh dari GeneBank dengan accession number seperti disajikan pada Lampiran 3.
Kategori nilai keragaman genetik, struktur populasi dan jarak genetik disajikan pada Tabel 1.
Kategori