2.4. Prosedur Penelitian
Tahapan penelitian dapat dilihat pada bagan alir penelitian dibawah ini :
Gambar 3. Bagan alir penelitian 2.5. Analisis Molekuler
Analisis molekuler untuk mendapatkan data fragmen DNA menggunakan metode DNA sequencing dengan primer CRK-CRE dilakukan di laboratorium Indonesia
Biodiversity Research Center IBRC, Bali. Proses analisis sampel dilaksanakan dengan
beberapa tahapan antara lain : 2.5.1. Ekstraksi DNA
Analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi yang dimulai dari pengambilan sampel jaringan. Sebelum dan sesudah jaringan diambil, pinset dicelupkan ke dalam
ethanol 96 dan dibakar dengan api bunsen. Isolasi DNA mitokondria menggunakan larutan Chelex 10 Walsh et al 1991. Berikutnya tube divortex dan disentrifuge
selama + 20 detik, kemudian dipanaskan dalam heat blok dengan suhu 95
o
C selama + 45 menit. Setelah dipanaskan, tube kembali divortex dan disentrifuge selama + 20 detik.
Larutan ekstraksi siap digunakan untuk amplifikasi. Dokumentasi
Sampling
Pemotongan Sirip
Botol Sampel
Ekstraksi DNA Amplifikasi DNA
DNA Elektroforesis
DNA Sekuensing DNA
Interpretasi data
Kesimpulan
2.5.2. Reaksi Rantai Polomerasu PCR
Amplifikasi dilakukan pada lokus mtDNA control region menggunakan primer forward CRK
5’-AGCTC AGCGC CAGAG CGCCG GTCTT GTAAA-3’ dan primer reverse CRE
5’-CCTGA AGTAG GAACC AGATG-3’Lee et al 1995. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 25 µL, menggunakan template DNA sebanyak 1 µ L. Dalam
setiap reaksi terdapat 2,5 µL 10x PCR buffer Applied Biosystems, 2.5 µL 10 mM dNTPs, 1.25 µL pada masing-masing primer 10 mM, 2 µL 25 mM MgCl2 solution,
0.125 µL AmplyTaq Red ™ Applied Biosystems, 1 µL 1x BSA dan 13.5 µL ddH2O.
Profil PCR meliputi denaturasi awal pada suhu 94 °C selama 15 detik, denaturasi pada 94 °C selama 30 detik, annealing pada 50 °C selama 30 detik, dan extension pada 72 °C
selama 45 detik, selama 72 °C untuk 5 menit dan proses ini terjadi pengulangan sebanyak 38 siklus.
2.5.3. Elektroforesis
Elektrofores merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan dan purifikasi DNA. Selain itu elektroforesis bermanfaat untuk bisa melihat
keberhasilan PCR melalui gel agarose 1 dengan cara 1 gram agarosa dimasukkan erlenmeyer kemudian ditambahkan 100 mL TAE 1X. Setelah itu dipanaskan di dalam
mikrowave, jika sudah larut merata ditambahkan 4 uL EtBr. Gel agarosa dituangkan di cetakan yang sudah dipasang sisir pembuat sumur dan didiamkan selama 30 menit. Hasil
elektroforesis kemudian di visualisasi menggunakan mesin ultraviolet dengan voltase 200 V dan arus 400 mA selama 30 menit.
2.5.4. DNA Sekuensing
Hasil PCR yang telah berhasil diamplifikasi kemudian dikirim ke Berkeley Sequencing Facility
USA dengan menggunakan metode Sanger et al 1977 untuk mendapatkan urutan pasang basah sekuen nukleotida.
2.6. Analisis Data
Analisis data dilakukan di laboratorium Indonesia Biodiversity Research Center IBRC, Bali dan laboratorium Marine Biodiversity dan Biosystymatics Ilmu Dan
Teknologi Kelautan, IPB. Sekuen control region mtDNA dianalisis menggunakan empat aplikasi yaitu MEGA5 Molecular Evolutionary Genetic Analysis Tamura et al 2011,
Arlequin 3.5 Excoffier dan Lischer 2009, DnaSP 4.0 Rozas et al 2003 dan Network 4.6.
2.6.1. Identifikasi Spesies
Proses identifikasi ikan tuna begitu sulit dikarenakan rusaknya karakter morfologi setelah ditangkap dan diawetkan dalam waktu yang lama dan bentuk morfologi yang
mirip akibat kedekatan genetik antar individu cukup tinggi, untuk itu diperlukan suatu pendekatan agar dapat memastikan individu yang ditemukan dengan menggunakan
aplikasi MEGA5 Tamura et al 2011. Pada software ini dilakukan proses penjajaran sekuen agar dapat melihat kemiripan yang nyata antar sekuens dengan metode DNA
Weight Matrix ClustalW 1.6 dan Translation Weight 0.5. Identifikasi spesies melalui aplikasi Blast Basic Local Aligment Tools yang tersedia pada program MEGA5.
Kategori