8 cacodylate buffer. Densitas optikal OD diukur dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung 100 µL suspensi hemosit, 50 µL cacodylate buffer pengganti trypsin, dan 50 µL
L-DOPA. Densitas optikal OD dari aktivitas PO dinyatakan sebagai formasi dopachrome dalam 100 µL hemolim.
2.7.4 Respiratory Burst RB Cheng et al. 2004
Respiratory burst dari hemosit diukur berdasarkan reduksi NBT nitroblue tetrazolium sebagai ukuran superoxide anion O
2 -
. Sebanyak 50 µL campuran hemolim-antikoagulan diinkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya
disentrifuse dengan kecepatan 3.000 rpm selama 20 menit dan supernatan dibuang. Ditambahkan 100 µL NBT dalam larutan HBSS hanks buffered salt
solution dengan konsentrasi 0,3 dan didiamkan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian disentrifuse 3.000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan
ditambahkan 100 µL metanol absolut untuk selanjutnya disentrifuse 3.000 rpm selama 10 menit supernatan dibuang. Pelet yang terbentuk kemudian dibilas
sebanyak 2 kali dengan metanol 70 . Selanjutnya 120 µL KOH 2M dan 140 µL DMSO dimethylsulfoxide ditambahkan untuk melarutkan pelet. Pelet yang
telah larut kemudian dimasukkan ke dalam microplate untuk diukur densitas optikal OD menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 630 nm.
Respiratory burst dinyatakan sebagai reduksi NBT per 10 µL hemolim.
2.7.5 Sintasan
Sintasan atau tingkat kelangsungan hidup udang uji dapat diketahui dari jumlah udang pada akhir perlakuan dibagi dengan jumlah udang awal Effendi
2004, dirumuskan sebagai berikut : Sintasan = [NtNo] x 100
Keterangan : No = Jumlah udang pada awal perlakuan ekor
Nt = Jumlah udang pada akhir perlakuan ekor 2.7.6
Perhitungan Bakteri dalam Usus
Perhitungan bakteri pada usus udang dilakukan pada awal pemeliharaan, akhir perlakuan dan akhir pemeliharaan setelah uji tantang. Dilakukan
9 perhitungan populasi bakteri total dan total bakteri Vibrio SKT-b
R
. Sampel udang diambil sebanyak 4 ekor dari masing-masing perlakuan yang dipilih secara acak.
Udang dibedah dan diambil ususnya, kemudian usus ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikrotube steril yang berisi air laut steril 1 mL dan digerus. Dari hasil
gerusan usus dalam air laut steril dilakukan pengenceran berseri. Selanjutnya hasil pengenceran berseri disebar pada media SWC agar sea water complete pada
tingkat pengenceran 10
-5
, 10
-6
,dan 10
-7
untuk perhitungan bakteri total dalam usus. Perhitungan total bakteri Vibrio SKT-b
R
tidak dilakukan pengenceran berseri 10 dan langsung disebar pada media TCBS agar thiosulfate citrate bile-salt sucrose
yang telah diberi rifampisin 50 µgmL. Perhitungan bakteri dilakukan
menggunakan metode hitungan cawan. 2.7.7
Perhitungan Populasi Bakteri Vibrio SKT-b
R
Media Pemeliharaan
Populasi Vibrio SKT-b
R
pada media pemeliharaan dengan perlakuan probiotik dilakukan setiap 5 hari sekali selama masa pemeliharaan. Sampel air
sebanyak 1 mL diambil wadah pemeliharaan perlakuan Pro dan Pro+BFT sebelum dan setelah dilakukan penambahan probiotik SKT-b
R
, kemudian dilakukan perhitungan bakteri dengan metode cawan sebar pada media TCBS agar yang
diberi rifampisin 50 µgmL yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
2.7.8 Kualitas Air
