7 terpisah dengan kepadatan 10 ekorL. Setelah dilakukan perendaman, udang uji
dikembalikan pada akuarium pemeliharaan. Pengamatan dan pemeliharaan setelah koinfeksi dilakukan selama 10 hari.
2.7 Parameter Pengamatan
2.7.1 Parameter Imun
Parameter imun udang yang diukur terdiri dari total haemocyte count THC, aktivitas phenoloxydase PO, dan respiratory burst RB yang dilakukan
sebelum dan sesudah uji tantang. Sampel darah diambil dari 8 ekor udang tiap perlakuan yang dipilih secara acak. Prosedur pengukuran parameter imun sebagai
berikut:
2.7.2 Total Haemocyte Count THC
Sebanyak 0,2 mL hemolim udang diambil dengan menggunakan jarum suntik 1 mL yang telah berisi 0,2 mL antikoagulan. Kemudian campuran
hemolim-antikoagulan divorteks hingga merata. Campuran hemolim-antikoagulan tersebut kemudian diteteskan pada haemocytometer. Selanjutnya THC langsung
dihitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
2.7.3 Aktivitas Phenoloxydase PO Liu dan Chen 2004
Aktivitas PO haemocyte diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA L-dihydroxyphenylalanine. Sebanyak 1 mL campuran
hemolim-antikoagulan disentrifuse pada 1.500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4
o
C. Supernatan dibuang dan pelet disuspensi kembali secara perlahan dengan menambahkan 1 mL larutan cacodylate-citrate buffer 0,01 M sodium
cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, pH 7 dan disentrifuse kembali 1.500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4
o
C. Supernatan yang terbentuk dibuang dan ditambahkan 200 µL cacodylate-citrate
buffer 0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, pH 7. Suspensi sel sebanyak 100 µL kemudian diinkubasi dengan 50 µL
trypsin 1 mgmL cacodylate buffer sebagai aktivator selama 10 menit pada temperatur 25-26
o
C. Selanjutnya ditambahkan 50 µL L-DOPA 3 mgmL cacodylate buffer, didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 800 µL
8 cacodylate buffer. Densitas optikal OD diukur dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung 100 µL suspensi hemosit, 50 µL cacodylate buffer pengganti trypsin, dan 50 µL
L-DOPA. Densitas optikal OD dari aktivitas PO dinyatakan sebagai formasi dopachrome dalam 100 µL hemolim.
2.7.4 Respiratory Burst RB Cheng et al. 2004
