37
9. Retensi provitamin A Retensi provitamin A dihitung berdasarkan ratio kandungan provitamin A
-karoten produk akhir yang dihitung sebagai jumlah provitamin A akhir terhadap jumlah -karoten awal yang ditambahkan. Untuk mengevaluasi retensi
provitamin A digunakan rumus sebagai berikut:
Retensi vitamin A =
10. Preparasi plasma dan hati pada masa deplesi dan replesi
Tikus dimatikan dengan cara cervical dislokation, darah ditampung dari jantung menggunakan syringe dan jarum needle yang mengandung EDTA 10.
Darah disentrifuge pada 10,000 g selama 5 menit kemudian plasma dipisahkan dan disimpan pada suhu -80
C. Hati tikus dipotong, dicuci dengan 0,9 larutan garam, tiriskan dan keringkan atau langsung dimasukkan dalam nitrogen cair ,
timbang lalu simpan pada suhu -80
o
C hingga dilakukan pengujian.
11. Analisis Retinol Plasma HPLC, Hosotani and Kitagawa, 2003 a Ekstraksi Retinol Plasma
Sejumlah 0.15 ml plasma dicampurkan dengan 0,35 ml air, 0,5 ml 3 Na- askorbat, 2 ml ethanol yang mengandung 0,135 BHT. Campuran selanjutnya
divortex selama 20 detik dan diinkubasikan selama 5 menit pada suhu 70
o
C. Dilanjutkan tahap saponifikasi, yaitu dengan menambahkan 1 ml 10 M KOH pada
suhu 70
o
C selama 30 menit, kemudian didinginkan. Kemudian ditambahkan 40 ml heksan yang mengandung 0,025 BHT sebagai extraction solvent larutan
pengekstrak. Selanjutnya divortex selama 10 menit, kemudian disentrifuge pada 500 xg selama 10 menit. Heksan dibuang kemudian dilakukan pencucian
sebanyak 3 kali menggunakan larutan pengekstrak. Ekstrak heksan yang diperoleh dicampur, selanjutnya dikeringkan pada suhu 40
o
C. Residunya dilarutkan kembali redissolved
dalam 50 L mobile phase, disaring dengan 0,45 M milipore dan 10 L diinjeksikan ke HPLC.
b Ekstraksi retinol hati
Satu gram hati dihomogenisasi dengan 10 ml HPLC grade water dalam homogenizer pada 13,500 RPM selama 5 menit. Sejumlah 0,3 ml homogenat
dicampurkan dengan 0,7 ml air, 0,5 ml 25 Na-askorbat, 2 ml methanol dan divortex selama 20 detik. Setelah diinkubasikan pada suhu 70
o
C selama 5 menit, sampel disponifikasi dengan 1 ml 10 M KOH pada suhu 70
o
C selama 30 menit, selanjutnya dinginkan. Ditambahkan sekitar 4 ml heksan sebagai larutan
pengekstrak, divortex selama 10 menit dan disentrifuge pada 500 xg selama 10 menit. Heksan selanjutnya dibuang dan dilakukan proses pencucian hingga 4 kali
menggunakan larutan pengekstrak. Ekstrak heksan yang diperoleh dicampurkan dan dievaporasi hingga kering pada suhu 40
o
C. Residunya dilarutkan kembali redissolve
dalam 50 L mobile phase, disaring melalui 0,45 M milipore dan 10 L diinjeksikan kedalam HPLC. Digunakan γ,5 m Simmetry C18 4,6x150 mm
Jumlah provitamin A produk akhir x 100 Jumlah provitamin A awal
