Kadar lemak dengan metode Soxhlet AOAC 1975 dalam

36 dikeringkan dengan N 2 . Residu kering ditambah 2 ml asetonitril ACN : dikhloromethan : methanol 65:30:5 sebagai fase gerak. Standar -karoten dicampurkan dalam petroleum ether, dievaporasi dan dicampurkan dengan dikhlorometan. Konsentrasi standar ditunjukkan secara spektrofotometri menggunakan koefisien ekstensi molar Etem 1 = 2530. Konsentrasi yang berbeda digunakan untuk analisa HPLC dan memplot grafik standar. Koefisien korelasi dihitung untuk menaksir kelinieran diantara konsentrasi standard dan puncak areagrafik. Sampel diencerkan untuk diinjeksikan dan pemisahan. Analisa dihubungkan dengan rata-rata aliran pelarut pada 1,5 ml per menit dengan sensitivitas detektor AUES 0,02 dan standar gelombang 450 nm menggunakan rumus: Kadar -karotenppm = x konsentrasi standar x fp b Persiapan standar -karoten AOAC 2005 Sejumlah 1 mg kristal -karoten ditimbang dalam tabung reaksi yang ditutup alufo, selanjutnya dilarutkan dengan sempurna dalam 2 ml chloroform CHCl 3 HPLC, kemudian diencerkan dengan 6 ml methanol MeOH HPLC. Selanjutnya diambil 0,5 ml dan diencerkan 10 kali dengan methanol:asetonitril 1:1. Larutan hasil pengenceran selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm dengan blanko methanol:asetonitril 1:1 menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi -karoten dalam larutan tersebut dapat dihitung berdasarkan nilai E 1 1 cm, yaitu absorbansi dari 1 larutan -karoten 10 mgml, 10µgµ L pada panjang gelombang 450 nm menggunakan kuvet 1 cm, sebagai berikut: 10 mgml Konsentrasi -karoten semu - 2600 Absorbansi pada 450 nm Keterangan: 2600 = nilai E 1 1 cm untuk 1 larutan -karoten pada panjang gelombang 450 nm Selanjutnya sejumlah 20 µL dari larutan encer tersebut diinjeksikan ke dalam HPLC dengan fase mobil asetonitril ACN : diklorometan: methanol 65μγ0μ5 untuk mendapatkan kemurnian all trans -karoten pada 450 nm. Dari persen kemurnian tersebut dapat diperoleh konsentrasi -karoten yang sebenarnya yaitu dengan cara mengalikan persen kemurnian dengan konsentrasi -karoten semu. Larutan -karoten selanjutnya disimpan pada suhu -20 C dan dihindarkan dari cahaya. 8. Rendemen Rendemen dihitung berdasarkan ratio jumlah gula yang dihasilkan gram, terhadap total nira ml dinyatakan dalam persen. Luasan puncak sampel Luasan puncak standar 37 9. Retensi provitamin A Retensi provitamin A dihitung berdasarkan ratio kandungan provitamin A -karoten produk akhir yang dihitung sebagai jumlah provitamin A akhir terhadap jumlah -karoten awal yang ditambahkan. Untuk mengevaluasi retensi provitamin A digunakan rumus sebagai berikut: Retensi vitamin A =

10. Preparasi plasma dan hati pada masa deplesi dan replesi

Tikus dimatikan dengan cara cervical dislokation, darah ditampung dari jantung menggunakan syringe dan jarum needle yang mengandung EDTA 10. Darah disentrifuge pada 10,000 g selama 5 menit kemudian plasma dipisahkan dan disimpan pada suhu -80 C. Hati tikus dipotong, dicuci dengan 0,9 larutan garam, tiriskan dan keringkan atau langsung dimasukkan dalam nitrogen cair , timbang lalu simpan pada suhu -80 o C hingga dilakukan pengujian.

11. Analisis Retinol Plasma HPLC, Hosotani and Kitagawa, 2003 a Ekstraksi Retinol Plasma

Sejumlah 0.15 ml plasma dicampurkan dengan 0,35 ml air, 0,5 ml 3 Na- askorbat, 2 ml ethanol yang mengandung 0,135 BHT. Campuran selanjutnya divortex selama 20 detik dan diinkubasikan selama 5 menit pada suhu 70 o C. Dilanjutkan tahap saponifikasi, yaitu dengan menambahkan 1 ml 10 M KOH pada suhu 70 o C selama 30 menit, kemudian didinginkan. Kemudian ditambahkan 40 ml heksan yang mengandung 0,025 BHT sebagai extraction solvent larutan pengekstrak. Selanjutnya divortex selama 10 menit, kemudian disentrifuge pada 500 xg selama 10 menit. Heksan dibuang kemudian dilakukan pencucian sebanyak 3 kali menggunakan larutan pengekstrak. Ekstrak heksan yang diperoleh dicampur, selanjutnya dikeringkan pada suhu 40 o C. Residunya dilarutkan kembali redissolved dalam 50 L mobile phase, disaring dengan 0,45 M milipore dan 10 L diinjeksikan ke HPLC. b Ekstraksi retinol hati Satu gram hati dihomogenisasi dengan 10 ml HPLC grade water dalam homogenizer pada 13,500 RPM selama 5 menit. Sejumlah 0,3 ml homogenat dicampurkan dengan 0,7 ml air, 0,5 ml 25 Na-askorbat, 2 ml methanol dan divortex selama 20 detik. Setelah diinkubasikan pada suhu 70 o C selama 5 menit, sampel disponifikasi dengan 1 ml 10 M KOH pada suhu 70 o C selama 30 menit, selanjutnya dinginkan. Ditambahkan sekitar 4 ml heksan sebagai larutan pengekstrak, divortex selama 10 menit dan disentrifuge pada 500 xg selama 10 menit. Heksan selanjutnya dibuang dan dilakukan proses pencucian hingga 4 kali menggunakan larutan pengekstrak. Ekstrak heksan yang diperoleh dicampurkan dan dievaporasi hingga kering pada suhu 40 o C. Residunya dilarutkan kembali redissolve dalam 50 L mobile phase, disaring melalui 0,45 M milipore dan 10 L diinjeksikan kedalam HPLC. Digunakan γ,5 m Simmetry C18 4,6x150 mm Jumlah provitamin A produk akhir x 100 Jumlah provitamin A awal