David dan Strout 1971 memaparkan ketentuan kekuatan antibiotik- antibakteri sebagai berikut: daerah hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat,
daerah hambatan 10-20 mm kuat, daerah hambatan 5-10 mm sedang, dan daerah hambatan kurang 5 mm lemah. Faktor yang mempengaruhi ukuran
daerah penghambatan, yaitu sensitivitas organisme, medium kultur, kondisi inkubasi, dan kecepatan difusi agar. Faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan
difusi agar, yaitu konsentrasi mikroorganisme, komposisi media, suhu inkubasi, dan waktu inkubasi Schlegel dan Schmidt 1994.
49
3. METODOLOGI
3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini diawali dengan melakukan koleksi contoh lamun segar di Pulau Pramuka Kepulauan Seribu, DKI Jakarta Gambar 5.
Gambar 5 Lokasi koleksi contoh lamun di Pulau Pramuka, DKI Jakarta Contoh lamun segar yang diperoleh kemudian dikeringkan alami, dijemur
dibawah sinar matahari kemudian diekstraksi di Laboratorium Kering, Bagian Hidrobiologi Laut, Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, FPIK
– IPB. Ekstrak lamun kemudian diuji, meliputi uji fitokimia, uji toksisitas dengan
menggunakan metode Brain Shrimp Lethal Toxic BSLT, dan uji bioantifouling dengan mekanisme aktivitas hambat bakteri. Uji fitokimia dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Teknologi Hasil Perairan FPIK – IPB,
dan uji bioantifouling dilakukan di Laboratorium mikrobiologi Pusat Penelitian Oseanografi P2O
– LIPI, sementara uji toksisitas dengan metode BSLT dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia FMIPA
– IPB. Proses pengambilan contoh lamun segar, ekstraksi dan evaporasi, serta
pelaksanaan uji fitokimia dilakukan sejak Maret – April 2011, sementara
pelaksanaan uji toksisitas serta uji bioantifouling dilakukan pada April – Mei
2012. Selama selang waktu tersebut, ekstrak kasar contoh lamun disimpan didalam botol vial dan diletakkan didalam freezer.
3.2. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini dibagi menjadi tiga bagian besar Tabel 2, yaitu alat dan bahan untuk pengambilan contoh lamun,
untuk ekstraksi, dan perlakuan uji. Perlakuan uji yang dilakukan meliputi uji fitokimia, uji toksisitas, dan uji bioantifouling.
Tabel 2 Alat dan bahan yang digunakan selama penelitian
Tahapan Alat
Bahan 1. Pengambilan contoh lamun
Masker Snorkel
Plastik Pisau selam
2. Ekstraksi bahan bioaktif
Alat gelas Contoh lamun
Evaporator Methanol
shaker bath n - heksana
Kertas saring Whatman Timbangan
3. Uji Fitokimia
a. alkaloid Tabung reaksi, Pipet, Gelas
piala asam sulfat 2N
pereaksi meyer pereaksi dragendorf
pereaksi wagner b. Steroid
Tabung reaksi, Pipet, Gelas piala
klorofom anhidrida asetat
asam sulfat pekat c. Flavonoid
Tabung reaksi, Pipet, Gelas piala
magnesium amil alkohol
alkohol d. Saponin
Tabung reaksi, Pipet, Gelas piala
HCL 2N e. Molish
Tabung reaksi, Pipet, Gelas piala
Asam sulfat pekat Pereaksi molisch
f. Benedict Tabung reaksi, Pipet, Gelas
piala Pereaksi benedict
g. Biuret Tabung reaksi, Pipet, Gelas
piala Pereaksi biuret
h. Ninhidrin Larutan ninhidrin
51
Tabel 2 Lanjutan Alat dan bahan yang digunakan selama penelitian
Tahapan Alat
Bahan
4. Uji toksisitas BSLT
Aerator Ekstrak sampel
Lampu Telur Artemia
salina Pipet volumetric
Air laut steril WheelTabung reaksi
5. Uji aktivitas hambat biofilm
antimikrofouling
Hotplate Biakan bakteri
biofilm Tabung reaksi
Marine Agar Kapas
Aquades Alumunium foil
TCBS Agar Autoklaf
Gelas ukur Sudip
Jarum ose Inkubator
Bunsen Cawan petri
Referigrator Vortex
Paper disc
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu koleksi contoh lamun, ekstraksi contoh lamun, uji fitokimia, uji toksisitas dengan metode BSLT,
dan uji bioantifouling. Tahapan penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 6.
3.3.1. Koleksi Contoh Lamun Proses koleksi dan preparasi contoh lamun ditampilkan dalam bentuk foto
pada Gambar 7. Metode koleksi contoh lamun pada penelitian ini diadopsi dari El-Hady et al. 2007 dan Jensen et al. 1998. El-Hady et al. 2007 memaparkan
teknik penanganan contoh daun lamun segar diambil langsung dari habitatnya, kemudian dibersihkan dari organisme penempel epifit, setelah bersih dari epifit
daun lamun dikeringkan alami sampai berat daun lamun menjadi konstan dan ditimbang dengan berat 50 gram. Contoh daun lamun ini diambil sebanyak tiga
kali ulangan pada setiap spesiesnya.
Tahapan Keluaran
Gambar 6 Skema tahapan penelitian
Gambar 7 Proses koleksi dan persiapan contoh lamun
KOLEKSI CONTOH LAMUN
Ekstraksi bioaktif lamun dengan metode bertingkat
Uji Fitokimia
Uji Toksisitas dengan metode BSLT
Uji Bioantifouling, dilakukan secara invitro terhadap bakteri
pembentuk biofilm Contoh lamun yang digunakan sebagai
bahan ekstraksi
1. Rendemen ekstrak lamun 2. Informasi jenis pelarut yang efisien
Kandungan golongan senyawa kimia dalam ekstrak kasar lamun
1. Nilai LC
50
dari ekstrak kasar lamun 2. Informasi jenis ektsrak yang bersifat
toksik 1. Diameter zona hambat
2. Informasi jenis ekstrak yang potensial sebagai bioantifouling
53
3.3.2. Ekstraksi komponen bioaktif contoh lamun
Proses ekstraksi contoh lamun yang dilakukan selama penelitian dapat dilihat pada Gambar 8. Contoh lamun yang telah siap diekstraksi, ditimbang
masing masing seberat 50gram, kemudian direndam pelarut non polar, n-hexana 75 ml dengan perbandingan 1:1,5 bv di dalam botol kaca, lalu dimaserasi
selama 24 jam El-Hady et al. 2007; Jensen et al. 1998. Larutan contoh lamun kemudian difiltrasi dengan menggunakan kertas saring. Filtrat contoh lamun yang
terisisa kemudian direndam kembali dengan pelarut polar, methanol 75 ml dengan perbandingan 1:1,5 bv di dalam botol kaca, lalu dimaserasi selama 24
jam. Setelah 24 jam, larutan contoh lamun difiltrasi dengan menggunakan kertas saring.
Larutan contoh lamun hasil filtrasi kemudian dievaporasi dengan menggunakan Rotary evaporator yang diaplikasikan pada suhu 50
C, sehingga diperoleh ekstrak kasar lamun dalam bentuk pasta. Pasta ekstrak kasar lamun
kemudian ditimbang agar dapat diketahui prosentase rendemen yang diperoleh.
Gambar 8 Proses ekstraksi dan hasil ekstraksi lamun
3.3.3. Uji Fitokimia ekstrak contoh lamun
Uji fitokimia merupakan salah satu uji kualitatif untuk mengetahui golongan senyawa yang tekandung dalam suatu organisme. Rangkaian proses uji
fitokimia selama penelitian ditampilkan pada Gambar 9. Ada delapan golongan senyawa yang akan diuji pada tahap ini, yaitu:
a Alkaloid. Sejumlah ekstrak dilarutkan ke dalam beberapa tetes asam
sulfat 2N, kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu meyer, dragendorf, dan wagner. Uji ini positif jika terbentuk endapan warna putih
pada larutan yang ditambahkan pereaksi meyer, endapan coklat pada yang
ditambahkan pereaksi dragendorf, dan endapan merah hingga jingga pada yang ditambahkan pereaksi wagner.
b Steroid. Sejumlah ekstrak dilarutkan ke dalam 2 ml kloroform, kemudian
ditambahkan 10 tetes anhidrida asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Uji ini positif jika larutan yang dihasilkan membentuk warna merah di awal
kemudian berubah menjadi biru atau hijau di akhir pengujian. c
Flavonoid. Sejumlah ekstrak ditambahkan bubuk magnesium Mg sebanyak 0,1 mg, kemudian ditambahkan larutan amil alcohol sebanyak
0,4 ml, selanjutnya ditambahkan kembali alkohol sebanyak 4 ml dan dikocok. Uji flavonoid positif jika larutan membentuk lapisan amil
alkohol dengan warna merah, kuning, atau jingga. d
Saponin. Sejumlah ekstrak dilarutkan dengan akuades kemudian dipanaskan, jika muncul busa dan bertahan hingga 30 menit maka uji
dilanjutkan dengan menambahkan 1 tetes HCl 2N. Uji saponin positif jika larutan mampu mempertahankan busa.
e Molisch. Sejumlah ekstrak lamun dilarutkan dengan akuades, lalu diambil
1 ml dan ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch serta 1 ml larutan asam sulfat H
2
SO
4
pekat. Uji ini positif jika ditandai dengan terbentuknya kompleks warna ungu diantara dua lapisan.
f Benedict. Sejumlah ekstrak lamun dilarutkan dengan akuades, kemudian
diambil delapan tetes dan dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi benedict, lalu dididihkan selama lima menit. Uji benedict positif jika larutan
membentuk warna hijau, kuning, atau membentuk endapan warna merah bata.
g Biuret. Uji ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan senyawa peptida.
Sejumlah ekstrak lamun yang dilarutkan dengan akuades diambil sebanyak 1 ml, kemudian ditambahkan 4 ml pereaksi biuret, lalu dikocok. Uji ini
positif jika larutan membentuk warna ungu. h
Ninhidrin. Uji ninhidrin dilakukan untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa asam amino. Sejumlah ekstrak lamun yang dilarutkan
dengan akuades diambil 2 ml, kemudian ditambahkan beberapa tetes
