3.3. Isolasi Bakteri Endofit dari Akar dan Batang Keji Beling
Isolasi bakteri endofit dari akar dan batang tanaman terlebih dahulu dilakukan sterilisasi permukaan menurut metode Radu and Kqueen 2002. Tahap
awal isolasi ialah mengambil akar dan batang tanaman keji beling dari tanah secara aseptis dengan menyemprotkan alkohol, kemudian dibungkus dengan kertas koran
dan dimasukkan ke dalam plastik yang telah disemprot alkohol dan dibawa ke laboratorium. Bagian akar dan batang tanaman dicuci dengan air mengalir selama
20 menit. Permukaan akar dan batang disterilisasi dengan merendamnya secara berturut-turut dalam larutan etanol 75 selama dua menit, larutan sodium
hipoklorit 5,3 selama lima menit, dan etanol 75 selama 30 detik. Selanjutnya akar dan batang dibilas dengan akuades steril sebanyak dua kali dan dikeringkan
dengan kertas saring steril. Setelah kering, bagian ujung kiri dan kanan akar dan batang tanaman dibuang ± 1 cm. Masing-masing akar dan batang dipotong menjadi
empat bagian dan diletakkan pada permukaan media NA yang telah dicampurkan dengan antibiotik ketokonazol 0,3 gram100 ml dengan posisi bekas potongan ke
arah media, kemudian diinkubasi pada suhu ruang 28-30
o
C selama 1-3 hari. Koloni yang muncul dari bagian akar dan batang tanaman sebelah dalam
disubkulturkan ke media NA yang baru sampai didapat biakan murni. Lampiran 1, hal 30.
3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Endofit
Isolat murni yang diperoleh dikarakterisasi morfologinya berdasarkan bentuk, warna, elevasi dan tepi koloni dan berdasarkan pewarnaan gram serta uji
biokimia seperti uji pati, uji sitrat, uji gelatin, uji motilitas, uji sulfida, uji katalase Lay, 1994. Lampiran 2, hal 31 .
3.5. Uji Daya Hambat Isolat Bakteri Endofit terhadap Jamur Patogen
Pengujian daya hambat isolat bakteri endofit terhadap jamur patogen dilakukan dengan menyediakan tabung reaksi sebanyak isolat bakteri yang ditemukan dan
satu tabung untuk kontrol. Sebanyak 10 ml NaCl 0,9 dimasukkan ke dalam
Universitas Sumatera Utara
masing-masing tabung reaksi secara aseptis. Isolat bakteri endofit diinokulasikan ke dalam tabung reaksi dengan menggunakan jarum ose bengkok, kemudian
disamakan kekeruhannya sesuai dengan OD
600
= 0,5 setara 10
8
CFUml. Kemampuan bakteri endofit dalam menghambat pertumbuhan jamur A.
flavus diuji dengan uji antagonisme in vitro. Tepi bagian yang aktif tumbuh dari
biakan jamur yang telah diinkubasi selama 2-3 hari diambil dengan menggunakan cork borer
, diinokulasikan pada agar MHA dengan jarak 3,5 cm dari kertas cakram tempat inokulan bakteri. Selanjutnya suspensi bakteri endofit diinokulasikan pada
cakram kertas berdiameter 0,6 cm sebanyak 10 µl di bagian tepi media, dibuat dua kali pengulangan. Biakan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama tiga hari. Akitivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk di sekitar
koloni. Diameter zona hambat dihitung dengan mengukur selisih radial pertumbuhan miselium jamur yang terhambat oleh isolat bakteri.
Pengukuran pertumbuhan A. flavus dilakukan dengan cara mengukur batas akhir pertumbuhan dari jamur patogen pada sumbu X dan batas akhir pertumbuhan
jamur patogen pada sumbu Y Gambar 3.1 dilakukan setelah terjadi penghambatan bakteri
endofit terhadap
jamur patogen
dengan rumus
[y-x]. Lampiran 3, hal 32. 2
Gambar 3.1. Metode pengukuran zona hambat bakteri endofit terhadap koloni jamur patogen: A. Koloni jamur; B. Zona hambat bakteri endofit; C.
Titik tengah jamur diletakkan; D. Koloni bakteri endofit; X. Diameter koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya; Y.
Diameter koloni jamur normal Suryanto et al., 2010.
3.6. Uji Daya Hambat Isolat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen
Kategori