masing-masing tabung reaksi secara aseptis. Isolat bakteri endofit diinokulasikan ke dalam tabung reaksi dengan menggunakan jarum ose bengkok, kemudian
disamakan kekeruhannya sesuai dengan OD
600
= 0,5 setara 10
8
CFUml. Kemampuan bakteri endofit dalam menghambat pertumbuhan jamur A.
flavus diuji dengan uji antagonisme in vitro. Tepi bagian yang aktif tumbuh dari
biakan jamur yang telah diinkubasi selama 2-3 hari diambil dengan menggunakan cork borer
, diinokulasikan pada agar MHA dengan jarak 3,5 cm dari kertas cakram tempat inokulan bakteri. Selanjutnya suspensi bakteri endofit diinokulasikan pada
cakram kertas berdiameter 0,6 cm sebanyak 10 µl di bagian tepi media, dibuat dua kali pengulangan. Biakan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama tiga hari. Akitivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk di sekitar
koloni. Diameter zona hambat dihitung dengan mengukur selisih radial pertumbuhan miselium jamur yang terhambat oleh isolat bakteri.
Pengukuran pertumbuhan A. flavus dilakukan dengan cara mengukur batas akhir pertumbuhan dari jamur patogen pada sumbu X dan batas akhir pertumbuhan
jamur patogen pada sumbu Y Gambar 3.1 dilakukan setelah terjadi penghambatan bakteri
endofit terhadap
jamur patogen
dengan rumus
[y-x]. Lampiran 3, hal 32. 2
Gambar 3.1. Metode pengukuran zona hambat bakteri endofit terhadap koloni jamur patogen: A. Koloni jamur; B. Zona hambat bakteri endofit; C.
Titik tengah jamur diletakkan; D. Koloni bakteri endofit; X. Diameter koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya; Y.
Diameter koloni jamur normal Suryanto et al., 2010.
3.6. Uji Daya Hambat Isolat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen
Universitas Sumatera Utara
Pengujian daya hambat isolat bakteri patogen menggunakan metode difusi cakram kertas. Cakram kertas ditetesi dengan suspensi isolat bakteri endofit
sebanyak 10 μl dan diletakkan di atas sebaran mikroba uji dengan OD
600
=0,5 pada cawan petri, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30°C sesuai dengan
metode Kirby-Bauer Drew et al., 1971; Wilkins et al., 1972; Mishra et al., 2006. Pengamatan dilakukan terhadap pengukuran zona hambat yang terbentuk di sekitar
cakram kertas yang menunjukkan adanya aktivitas antimikroba. Lampiran 4, hal 33.
3.7. Ekstraksi Bakteri Endofit
Ekstraksi bakteri endofit yang telah diuji secara in vitro diekstraksi dengan metode yang dilakukan Nofiani et al., 2009 yang dimodifikasi dari segi media
dan kecepatan sentrifugasi. Bakteri yang memiliki aktivitas antimikroba ditumbuhkan pada media NA dengan metode oles, dan diinkubasi selama 5-6 hari.
Media selanjutnya dicacah Lampiran 8, hal 35 dan direndam ke dalam erlenmeyer yang berisi metanol selama 72 jam dan dibungkus dengan aluminium untuk
menghindari kerusakan karena cahaya. Maserat disaring sebanyak tiga kali ulangan. Maserat disentrifuse pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan
dipekatkan dengan rotarievaporator pada suhu tidak lebih dari 50±2
o
C untuk mendapatkan ekstrak yang siap digunakan. Lampiran 5, hal 33.
3.8. Pengamatan Hifa Abnormal Jamur Patogen
Pengamatan secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati ujung miselium pada daerah zona hambat jamur patogen. Ujung miselium A. flavus yang
tumbuh pada permukaan media dipotong berbentuk block square, kemudian diletakkan pada gelas objektif. Selanjutnya pertumbuhan miselium jamur patogen
diamati adanya abnormalitas, berupa pembengkokan ujung miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium lisis dan miselium kerdil
Lorito et al., 1992. Lampiran 6, hal 34.
3.9. Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak Metanol Bakteri Endofit terhadap Bakteri dan Jamur Patogen
Universitas Sumatera Utara
Pengujian aktivitas antimikroba ekstrak metanol bakteri endofit terhadap jamur patogen dilakukan dengan cara uji antagonisme yaitu biakan kultur jamur A. flavus
yang telah diinkubasi selama 2-3 hari diambil dengan cork borer yang berjarak 3,5 cm dari kertas cakram tempat inokulan bakteri. Selanjutnya ekstrak antimikroba
diinokulasikan 10 μl pada kertas cakram diameter 0,6 cm di bagian tepi media
MHA, dibuat dua kali pengulangan. Biakan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama tiga hari. Akitivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang
terbentuk di sekitar koloni. Diameter zona hambat dihitung dengan mengukur selisih radial pertumbuhan miselium jamur yang terhambat oleh isolat bakteri serta
diamati hifa abnormal yang terbentuk. Pengujian terhadap bakteri patogen dilakukan dengan menyebarkan suspensi
kultur bakteri uji di atas media agar MHA. Cakram kertas ditetesi dengan ekstrak antimikroba sebanyak 10
μl dan diletakkan di atas sebaran bakteri uji dengan OD
600
=0,5, lalu diinkubasi pada suhu 28-30°C selama tiga hari. Konsentrasi ekstrak metanol yang digunakan yaitu 40, 60, 80 dan 100, yang dilarutkan dengan
DMSO. Sebagai kontrol - digunakan pelarut DMSO, kontrol + untuk jamur digunakan cakram kertas nystatin, sedangkan untuk bakteri digunakan cakram
kertas kloramfenikol. Pengamatan dilakukan terhadap pengukuran zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram kertas yang menunjukkan adanya aktivitas
antimikroba. Lampiran 7, hal 34.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit dari Tanaman Keji Beling
Dari hasil isolasi yang telah dilakukan terhadap bagian akar dan batang tanaman keji beling Strobilanthes crispus, diperoleh 12 isolat bakteri endofit yaitu AJ1,
AJ2, AJ3, AJ4, AJ5, AJ6, AJ7, BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5 yang memiliki potensi dalam menghambat pertumbuhan beberapa mikroba patogen. Potensi isolat-isolat
tersebut ditunjukkan dengan adanya penghambatan mikroba patogen uji di sekitar koloni.
Karakterisasi yang dilakukan pada isolat yaitu karakterisasi morfologi sel dan morfologi koloni serta karakterisasi sifat biokimia yang meliputi uji hidrogen
sulfida, uji sitrat, uji motilitas, uji pati, uji gelatin dan uji katalase. Karakteristik morfologi bentuk yaitu bundar dan tidak beraturan, untuk tepi keriting, bulat,
berombak, elevasi yaitu rata, warna krem, bentuk sel kokus, penataan sel mono, diplo, strepto dan staphylo, serta pewarnaan Gram + maupun Gram -. Secara
umum isolat bakteri endofit menunjukkan uji positif terhadap hidrolisis pati, hidrolisis gelatin, uji sitrat, uji katalase, motilitas berbentuk pedang dan tidak
terdapatnya endapan hitam. Uji positif untuk keretakan media ditunjukkan oleh isolat BJ4. Untuk isolat AJ5, AJ6, BJ1, BJ2 dan BJ4 dapat memfermentasi glukosa,
sukrosa dan laktosa, isolat AJ1, AJ3, AJ4, AJ7 dan BJ3 hanya memfermentasi glukosa saja, sedangkan isolat AJ2 dan BJ5 tidak dapat memfermentasi gula
apapun, baik itu glukosa, sukrosa maupun laktosa. Hasil karakterisasi morfologi dan biokimia ditampilkan pada Tabel 4.1.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.1. Karakterisasi isolat bakteri endofit yang diperoleh dari tanaman keji beling
Kode Isolat
Ciri Morfologi koloni Gr
am B
ent uk
Penataan TSIA
K at
al as
e Mot
il it
as Sit
rat G
el at
in Pat
i G
lukosa Sukros
a Lakt
os a
Endapan R
et aka
n
AJ1 AJ2
AJ3 AJ4
AJ5 AJ6
AJ7 BJ1
BJ2 BJ3
BJ4 BJ5
bundar, keriting, rata, krem bundar, bulat, rata, krem
bundar, bulat, rata, krem bundar, bulat, rata, krem
bundar, bulat, rata, krem bundar, bulat, rata, krem
Tidak beraturan, berombak, rata, krem bundar, berombak, rata, krem
bundar, keriting, rata, krem bundar, keriting, rata, krem
bundar, keriting, rata, krem bundar, keriting, rata, krem
- -
+ -
- -
- -
- -
+ +
kokus kokus
kokus kokus
kokus kokus
kokus kokus
kokus kokus
kokus kokus
Mono, strepto Mono, diplo, strepto
Mono, diplo, staphylo Mono, diplo, strepto
Mono, diplo, strepto Mono, diplo, strepto
Mono, diplo, strepto Mono, diplo, strepto
Mono, diplo, strepto Mono, diplo, strepto
Mono, diplo, strepto Mono, strepto
+ -
+ +
+ +
+ +
+ +
+ -
- -
- -
+ +
- +
+ -
+ -
- -
- -
+ +
- +
+ -
+ -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -
+ -
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
Keterangan: + : Positif
- : Negatif AJ : Bagian akar
BJ : Bagian batang
Universitas Sumatera Utara
4.2. Uji Daya Hambat Isolat Bakteri Endofit Terhadap Pertumbuhan Bakteri dan Jamur Patogen