Bahan-bahan Bagan Penelitian Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Bunga Kupu-Kupu Rambat (Bauhinia kockiana Lour.)

BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Alat-alat 1. Spektrofotometer UV-Vis 2. Spektrofotometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz 3. Spektrofotometer FT-IR 2Shimadzu 4. Rotarievaporator Bűchi R-114 5. Labu rotarievaporator 1000 mL Schoot Duran 6. Ekstraktor 5000 mL Schoot Duran 7. Kolom kromatografi Pyrex 8. Alat destilasi 9. Lampu UV 254 nm356 nm UVGL 58 10. Neraca analitis Mettler AE 200 11. Corong Kaca 12. Corong Pisah 500 ml Pyrex 13. Gelas ukur Pyrex 14. Labu takar 250 mL Pyrex 15. Tabung reaksi Pyrex 16. Botol vial 15 mL 17. Gelas Erlenmeyer Pyrex 18. Beaker Glass Pyrex 19. Statif dan klem 20. Penangas air 21. Batang pengaduk 22. Chamber 23. Pipa Kapiler 24. Spatula 25. Pipet Tetes

3.2 Bahan-bahan

Universitas Sumatera Utara 1. Daun tumbuhan Bunga Kupu-kupu rambat 2. Metanol Destilasi 3. Etil asetat Teknis 4. Aquadest 5. N-heksana Teknis 6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KgA 7. FeCl 3 5 8. NaOH 10 9. Serbuk Mg 10. HCl p 11. H 2 SO 4p 12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6 14. Kapas 15. Kloroform Teknis 16. Plat KLT silika gel 60 F 254 E.Merck.Art 554

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat yang diperoleh dari daerah area kampus Universitas Sumatera Utara Padang bulan Medan. Daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan Bunga kupu-kupu rambat sebanyak 1200 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat

Serbuk daun bunga kupu-kupu rambat diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut: 1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun bunga kupu-kupu rambat yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer 2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer 3. Didiamkan selama 1 malam 4. Disaring 5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 3 tabung reaksi 6. Ditambahkan masing-masing pereaksi 7. Dilakukan perlakuan yang sama dengan menggunakan pelarut etil asetat dan diperoleh hasil yang sama sebagai berikut: a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl p menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III: dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan Universitas Sumatera Utara

3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Bunga Kupu-kupu Rambat

Serbuk daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat ditimbang sebanyak 1200 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 5 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu di hidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di panaskan diatas penangas air selama ± 1 jam. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1.02 g.

3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 vv. Universitas Sumatera Utara Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT kemudian dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n- heksana:etil asetat 80:20, 70:30, 60:40,50:50 vv. 3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom Isolasi senyawa flavonoida dilakukan dengan kolom kromatografi terhadap ekstrak pekat kloroform. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu sistem pelarut n-heksana:etil asetat 90:10, 80:20, 70:30, 60:40,50:50 vv. Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70- 230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n- heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 1,02 g ekstrak pekat kloroform dengan silika gel dengan pelarut etil asetat, kemudian diuapkan hingga pelarut etil asetat habis menguap dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, 60:40 dan 50:50 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama, lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian dibiarkan sampai semua pelarut habis menguap dan diperoleh kristal.

3.3.6 Pemurnian

Universitas Sumatera Utara Kristal yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum. Kemudian dilakukan kembali kromatografi kolom dengan fase gerak yang seragam yaitu n-heksana : eti asetat 60:40 vv. Kristal hasil kromatografi kolom direkristalisasi dengan menggunakan etil asetat dan n-heksana hingga diperoleh senyawa murni yang dibuktikan dengan noda yang tunggal pada uji KLT dan juga peleburan yang serentak pada uji titik lebur.

3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 60:40 vv, dan kloroform:metanol 80:20 vv. Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.

3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan uji dengan tiga jenis spektroskopi yaitu Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah FT-IR dan Spektrometer Resonansi Magnet Inti Proton 1 H-NMR. Universitas Sumatera Utara

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

A nalisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut dan diperoleh data seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4.1.

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan KBr sebagai pelarut dan diperoleh data seperti dilihat pada Gambar 4.2.

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H- NMR Analisis dengan alat Spektrometer 1 H-NMR dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan Aseton- d6 sebagai pelarut dan diperoleh data seperti dilihat pada Gambar 4.3. Universitas Sumatera Utara 3.4 Bagan Skrining Fitokimia 3.4.1 Maserasi dengan menggunakan pelarut metanol 10 gram serbuk kering halus daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat Bauhinia kockiana .Lour Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 3 tabung reaksi Tabung I Larutan Hijau Kebiruan Tabung II Larutan Hijau Kebiruan Tabung III Larutan Hijau Kebiruan Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan Orange Kekuningan Positif Fenolik Positif Fenolik Positif Fenolik Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Maserasi dengan menggunakan pelarut etil asetat

10 gram serbuk kering halus daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat Bauhinia kockiana .Lour Diekstraksi maserasi dengan etilasetat Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 3 tabung reaksi Tabung I Larutan Kuning kecoklatan Tabung II Larutan Kuning kecoklatan Tabung III Larutan Kuning kecoklatan Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan Orange Kekuningan Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Universitas Sumatera Utara

3.5 Bagan Penelitian

1200 g serbuk daun tumbuhan bunga kupu-kupu rambat Bauhinia kockiana Lour Ampas Ekstrak pekat metanol Ekstrak etil asetat Ekstrak pekat etil asetat Ekstrak metanol dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana secara berulang-ulang sampai bening Residu Lapisan metanol Lapisan n-heksana tidak dilanjutkan karena nonflavonoid Ekstrak metanol asam Residu Lapisan Klorofom Lapisan ekstrak metanol asam dimaserasi dengan metanol didiamkan selama ± 24 jam diulangi sebanyak 5 kali disaring diuji dengan FeCl 3 5 dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan sampai semua pelarut metanol habis dilarutkan dengan etil asetat secara berulang ulang sampai negatif disaring dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan sampai semua pelarut etil asetat menguap diuji dengan FeCl 3 5 dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga pekat diuji dengan larutan Bennedict dihidrolisa dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama ±1 jam didinginkan disaring diekstraksi partisi dengan kloroform hingga lapisan kloroform negatif saat diuji dengan FeCl 3 5 diuapkan hingga pekat Universitas Sumatera Utara Lanjutan Ekstrak pekat kloroform diuji dengan FeCl 3 5 diuji Kromatografi Lapis Tipis untuk mengetahui eluen n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 vv dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak eluen n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40, 50:50vv ditampung tiap fraksi sebanyak ± 10 mL dalam botol vial digabung fraksi dengan Rf yang sama diuji Kromatografi Lapis Tipis fraksi 1- 10 90 : 10vv fraksi 11- 25 80 : 20vv fraksi 26- 50 70 : 30vv fraksi 51- 80 60 : 40vv fraksi 81-120 50 : 50vv hasil negatif hasil positif hasil positif hasil positif hasil positif dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dengan eluen n-heksana:etil asetat 60:40vv dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak eluen n-heksana : etil asetat 60:40vv Senyawa murni dianalisis Kromatografi Lapis Tipis diuapkan dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis, spektrofotometer Inframerah FT-IR, spektrometer 1 H-NMR hasil analisis diuji Kromatografi Lapis Tipis digabung fraksi dengan Rf yang sama fraksi 1- 9 60 : 40vv fraksi 10- 25 60 : 40vv hasil positif hasil positif direkristalisasi Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian