3.3.3. Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford 1976
Penentuan kadar protein ekstrak sarkoplasma dan miofibril dilakukan dengan metode Bradford menggunakan serum albumin sapi BSA sebagai
standar. Sampel filtrat ekstrak protein direaksikan dengan pewarna coomasie briliant blue
sebagai komponen utama pereaksi bradford. Pereaksi Bradford dibuat dengan melarutkan 100 mg coomasie briliant blue
G-200 ke dalam 50 ml etanol 95. Kemudian ditambahkan 100 ml asam fosfat 85 wv dan volume akhir larutan dibuat menjadi 1 liter, lalu disaring.
Standar dibuat dengan melarutkan 100 mg serum albumin sapi BSA ke dalam 50 ml air destilata, kemudian diencerkan sampai volumenya mencapai 100
ml konsentrasi 1 mgml. Dari konsentrasi 1 mgml, dibuat satu seri pengenceran larutan standar.
Untuk penetapan protein diperlukan sebanyak 0,1 ml larutan standar dari masing-masing seri konsentrasi, 0,1 ml sampel dan 0,1 ml air destilata sebagai
blanko. Ke dalam masing-masing larutan, ditambahkan 5 ml pereaksi bradford. Setelah didiamkan selama 5 menit, larutan dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 595 nm. Konsentrasi protein ditentukan berdasarkan kurva standar serum albumin sapi BSA.
3.3.4. Penentuan Karakteristik Ekstrak Protein dengan Elektroforesis SDS- PAGE Laemmli 1970
Elektroforesis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE dilakukan dengan metode Laemmli 1970, untuk menentukan berat molekul
protein ekstrak protein sampel. Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel
yang dielektroforesis adalah ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril hasil ekstraksi dari sampel ikan tongkol, udang jerbung dan kerang hijau. Beberapa
tahapan utama yang harus dilakukan dalam melakukan elektroforesis SDS-PAGE adalah 1 pembuatan separating gel, 2 pembuatan stacking gel, 3 persiapan
sampel, 4 running gel, 5 pewarnaan gel, 6 destaining gel, dan 7 penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan
larutan kerja untuk analisis SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 2.
a. Pembuatan separating gel
Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 ml larutan A dipipet
ke dalam gelas piala, kemuadian ditambakan 2.5 ml larutan B dan 3.5 ml akua-biodestilat. Campuran kemuadian diaduk perlahan dengan
menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µl APS 10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan
perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikro pipet sampai
sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami
polimerisasi selama 30-60 menit. b.
Pembuatan stacking gel Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan
tissue. Akua-biodestilat, larutan A dan larutan C masing-masing sebanyak 0.67 ml dan 1.0 ml dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan
dengan cara menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µl APS 10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali
dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel
dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab
ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Bufer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
c. Preparasi dan injeksi sampel
Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl bufer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air
mendidih 100 °C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur
menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl. Salah satu sumur diinjeksikan protein marker sebanyak 7.5 µl protein marker.
Kategori