Saran SIMPULAN DAN SARAN

Lampiran 4. RumusFormula pembuatan larutan-larutan untuk imunoblotting 1. Buffer transfer Sebanyak 2.9 g Tris base dan 14.5 g glisin dilarutan dalam 500 ml air destilata. Kemudian ditambahkan dengan 200 ml metanol dan ditepatkan volumenya sampai dengan 1 liter. Simpan pada suhu 4 °C. 2. Larutan pewarna amido black Amido black 0.1 g. metanol 20 ml. asam asetan glasial 10 ml. dicampurkan dan di tera dengan akuades sampai dengan volumenya 100 ml. 3. Larutan substrat DAB Roche Sebanyak 0.5 ml DAB konsentrat ditambahkan dengan 4.5 ml DAB buffer perbandingan 1:10. Lampiran 5. Kurva protein standar BSA pada penetapan kadar protein ekstrak sampel udang jerbung, ikan tongkol dan kerang hijau Konsentrasi mgml Absorbansi Rata-Rata 0.1 0.1538 0.1543 0.1548 0.2 0.3029 0.3015 0.3001 0.3 0.4171 0.4145 0.4119 0.4 0.5047 0.5043 0.5039 0.5 0.6441 0.64335 0.6426 0.7 0.8319 0.8272 0.8225 0.8 0.9667 0.96405 0.9614 0.9 1.0185 1.01475 1.011 1 1.0927 1.0895 1.0863 Miofibril.udang 1:5 0.2204 0.22025 0.2201 Sarkoplasma.udang 1:5 0.3309 0.33025 0.3296 Miofibril.tongkol 1:5 0.2724 0.27255 0.2727 Sarkoplasma.tongkol 1:5 0.3564 0.3541 0.3518 Miofibril.kerang 0.2333 0.2336 0.2339 Sakoplasma.kerang 1:5 0.1649 0.1635 0.1621 Lampiran 6. Hasil perhitungan rendemen ekstrak dan analisis total protein dalam daging udang jerbung, ikan tongkol dan kerang hijau - Perhitungan rendemen ekstrak Jenis protein Kadar protein Bradford mgml Volume ekstrakml gram sampel Total protein gram Rendemen Sarko.udang 1.154 390 20.9 0.450 2.15 Miof.Udang 0.627 390 20.9 0.244 1.17 Sarko.tongkol 1.269 390 19.72 0.495 2.51 Miof.tongkol 0.878 390 19.72 0.342 1.74 Sarko.kerang 0.691 390 20 0.269 1.35 Miof.kerang 0.176 390 20 0.068 0.34 - Analisis total protein Jenis Protein Berat sampel gram Total protein Kjeldahl Total protein terekstrak gram gram sarkoplasma miofibril Udang jerbung 20.9 13.96 2.92 0.45 0.244 Ikan Tongkol 19.72 16.44 3.24 0.495 0.342 Kerang Hijau 20 14.03 2.81 0.269 0.068 Lampiran 7. Protein alergen dari produk laut seafood yang terdaftar dalam IUIS International Union of Immunological Societies Sumber : www.allergen.org Grup Sumber species Nama alergen Nama biokimiawi Berat molekul kDa Arthropoda Archaeopotamobius sibiriensis Crustacean species Arc s 8 Triosephosphate isomerase ~28 Artemia franciscana Brine shrimp Art fr 5 Myosin, light chain 1 ~17.5 Charybdis feriatus Crab Cha f 1 Tropomyosin 34 Crangon crangon North Sea shrimp Cra c 1 Tropomyosin ~38 Cra c 2 Arginine kinase ~45 Cra c 4 Sarcoplasmic calcium- binding protein ~25 Cra c 5 Myosin, light chain 1 ~17.5 Cra c 6 Troponin C ~21 Cra c 8 Triosephosphate isomerase ~28 Homarus americanus American lobster Hom a 1 Tropomyosin Hom a 3 Myosin light chain 2 ~23 Hom a 6 Troponin C ~20 Litopenaeus vannamei White shrimp Lit v 1 Tropomyosin 36 Lit v 2 Arginine kinase Lit v 3 Myosin, light chain 2 20 Lit v 4 Sarcoplasmic calcium- binding protein 20 Metapenaeus ensis Shrimp Met e 1 Tropomyosin Pandalus borealis Northern shrimp Pan b 1 Tropomyosin 37 Penaeus aztecus Shrimp Pen a 1 Tropomyosin 36 Penaeus indicus Shrimp Pen i 1 Tropomyosin 34 Penaeus monodon Black tiger shrimp Pen m 1 tropomyosin 38 Pen m 2 arginine kinase 40 Pen m 3 Myosin light chain 2 Pen m 4 Sarcoplasmic calcium binding protein Pen m 6 Troponin C Molusca Haliotis midae Abalone Hal m 1 49 Helix aspersa Brown garden snail Hel as 1 Tropomyosin 36 Todarodes pacificus Squid Tod p 1 Tropomyosin 38 Chordata Gadus callarias Baltic cod Gad c 1 Beta-parvalbumin 12 Clupea harengus Atlantic herring Clu h 1 Beta-parvalbumin 12 Gadus morhua Atlantic cod Gad m 1 Beta-parvalbumin 13 Salmo salar Atlantic salmon Sal s 1 Beta-parvalbumin 1 12 Sal s 2 Beta-Enolase 47.3 Sebastes marinus Ocean perch, redfish, snapper Seb m 1 Beta-parvalbumin 11 Thunnus albacares Yellowfin tuna Thu a 1 Beta-parvalbumin 11 Lampiran 8. Data Rf sub unit protein Lampiran 8a. Standar marker Pita ke- Jenis protein BM kDa Log BM Jarak pergerakan cm Rf 1 β-galactosidase 116 2.0645 1.81 0.157 2 BSA 66.2 1.8209 3.4 0.296 3 Ovalbumin 45 1.6532 5.41 0.470 4 Lactate dehydrogenase 35 1.5441 6.92 0.602 5 Rease Bsp981 25 1.3979 8.86 0.770 6 β-lactoglobulin 18.4 1.2648 10.47 0.910 7 lysozyme 14.4 1.1584 10.97 0.954 Range 11.5 1.000 1 2 3 4 5 6 M: Standar marker 1: Tongkol Sarkoplasma 2: Tongkol Miofibril 3: Kerang Sarkoplasma 4: Kerang Miofibril 5: Udang Sarkoplasma 6: Udang Miofibril Lampiran 8b. Sampel Ikan Tongkol Fraksi Sarkoplasma pita ke- Jarak pergerakan cm Rf Log BM BM kDa Ketebalan band 1 1.17 0.102 2.068 117.06 453.435 1.19 2 1.78 0.155 2.013 103.13 1058.799 2.78 3 2.34 0.203 1.963 91.81 998.092 2.62 4 4.14 0.360 1.801 63.19 4289.234 11.26 5 4.86 0.423 1.736 54.41 3881.506 10.19 6 5.42 0.471 1.685 48.44 1322.678 3.47 7 6.36 0.553 1.600 39.85 7983.941 20.95 8 6.77 0.589 1.563 36.60 6205.648 16.29 9 7.91 0.688 1.461 28.89 4403.577 11.56 10 8.72 0.758 1.388 24.42 486.556 1.28 11 9.79 0.851 1.291 19.55 663.263 1.74 12 10.49 0.912 1.228 16.91 1300.678 3.41 13 11.18 0.972 1.166 14.65 5053.234 13.26 Range 11.5 Total 38100.641 100.00 Fraksi Miofibril pita ke- Jarak pergerakan cm Rf Log BM BM kDa Ketebalan band 1 1.59 0.138 2.031 107.28 441.314 2.67 2 1.84 0.160 2.008 101.86 639.314 3.87 3 2.55 0.222 1.944 87.90 646.192 3.91 4 3.19 0.277 1.886 76.96 1363.142 8.25 5 3.65 0.317 1.845 69.95 1853.263 11.22 6 4.35 0.378 1.782 60.49 1814.506 10.99 7 5.67 0.493 1.663 45.99 384.728 2.33 8 4.85 0.422 1.737 54.53 437.849 2.65 9 5.24 0.456 1.701 50.28 485.971 2.94 10 6.23 0.542 1.612 40.94 1058.263 16.41 11 6.51 0.566 1.587 38.63 3086.648 18.69 12 9.35 0.813 1.331 21.42 1336.799 8.09 13 9.95 0.865 1.277 18.91 1328.435 8.04 14 10.55 0.917 1.223 16.70 1639.142 9.92 15 11.19 0.973 1.165 14.62 5570.87 33.73 Range 11.5 Total 16515.566 100.00 Lampiran 8c. Sampel Kerang Hijau Fraksi Sarkoplasma pita ke- Jarak pergerakan cm Rf Log BM BM kDa Ketebalan band 1 2.31 0.201 1.965 92.35 716.678 5.96 2 2.62 0.228 1.937 86.59 742.678 6.17 3 3.12 0.272 1.892 78.04 613.435 5.10 4 4.43 0.386 1.774 59.45 2828.062 23.51 5 5.18 0.451 1.706 50.87 1516.971 12.61 6 6.39 0.556 1.597 39.56 1528.263 12.71 7 7.14 0.621 1.530 33.85 1942.627 16.15 8 7.95 0.692 1.456 28.61 585.678 4.87 9 8.85 0.770 1.375 23.73 324.899 2.70 10 10.76 0.936 1.203 15.95 590.435 4.91 11 11.22 0.977 1.161 14.50 638.314 5.31 Range 11.5 Total 12028.04 100.00 Fraksi Miofibril pita ke- Jarak pergerakan cm Rf Log BM BM kDa ketebalan band 1 0.44 0.038294 2.134193 136.21 1081.849 31.78 2 2.25 0.195822 1.970852 93.51 842.556 24.75 3 9.63 0.83812 1.304853 20.18 643.971 18.92 4 10.47 0.911227 1.229049 16.95 282.435 8.30 5 11 0.957354 1.181219 15.18 553.385 16.26 Range 11.5 Total 3404.196 100.00 Lampiran 8d. Sampel Udang Jerbung Fraksi Sarkoplasma Pita ke- Jarak pergerakan cm Rf Log BM BM kDa ketebalan band 1 0.18 0.016 2.158 143.77 169.899 0.54 2 1.06 0.092 2.078 119.74 237.021 0.76 3 1.49 0.130 2.039 109.51 629.192 2.01 4 2.36 0.205 1.961 91.40 3088.749 9.88 5 2.73 0.238 1.928 84.63 1159.021 3.71 6 2.93 0.255 1.909 81.19 1088.607 3.48 7 3.7 0.322 1.840 69.18 960.556 3.07 8 3.91 0.340 1.821 66.23 1293.314 4.14 9 4.11 0.358 1.803 63.53 618.899 1.98 10 4.64 0.404 1.755 56.91 2896.627 9.27 11 4.88 0.425 1.734 54.14 902.263 2.89 12 5.72 0.498 1.658 45.47 4548.648 14.55 13 6.32 0.550 1.604 40.14 1536.335 4.91 14 6.72 0.585 1.567 36.94 925.092 2.96 15 7.19 0.626 1.525 33.50 1217.799 3.90 16 7.63 0.664 1.485 30.57 941.678 3.01 17 8.1 0.705 1.443 27.73 839.385 2.68 18 9.33 0.812 1.332 21.47 578.971 1.85 19 9.87 0.859 1.283 19.20 4761.941 15.23 20 10.51 0.915 1.225 16.81 258.556 0.83 21 10.85 0.944 1.195 15.66 374.899 1.20 22 11.1 0.966 1.172 14.87 2234.849 7.15 Range 11.5 Total 31262.301 100.00 Lampiran 8d. Lanjutan Fraksi Miofibril Pita ke- Jarak pergerakan cm Rf Log BM BM kDa ketebalan band 1 1.58 0.138 2.031 107.48 213.192 0.79 2 1.89 0.164 2.003 100.77 3399.385 12.61 3 2.12 0.185 1.983 96.07 1683.435 6.25 4 2.38 0.207 1.959 91.02 1296.142 4.81 5 2.74 0.238 1.927 84.46 416.021 1.54 6 3.08 0.268 1.896 78.70 385.021 1.43 7 5.04 0.439 1.719 52.37 691.556 2.57 8 6.56 0.571 1.582 38.19 5910.113 21.93 9 6.82 0.594 1.558 36.18 1237.142 4.59 10 7.27 0.633 1.518 32.95 605.849 2.25 11 7.74 0.674 1.475 29.88 729.263 2.71 12 8 0.696 1.452 28.31 676.556 2.51 13 8.82 0.768 1.378 23.88 1643.213 6.10 14 9.55 0.831 1.312 20.52 932.728 3.46 15 9.86 0.858 1.284 19.24 1491.799 5.53 16 10.17 0.885 1.256 18.04 2608.991 9.68 17 11 0.957 1.181 15.18 3032.92 11.25 Range 11.5 Total 26953.326 Lampiran 9. Data hasil uji ELISA penentuan total IgE serum No Kode serum Konsentrasi serum Kontrol negatif SD Mean+2SD Total IgE serum uji 1 2 rataan 1 2 rataan 1 A 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.212 0.163 0.188 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.100 0.106 0.103 2 B 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.255 0.052 0.154 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.167 0.056 0.112 3 C 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.110 0.098 0.104 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.078 0.081 0.080 4 D 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.153 0.269 0.211 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.119 0.167 0.143 5 E 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.294 0.251 0.273 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.213 0.168 0.191 6 F 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.340 0.293 0.317 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.144 0.234 0.189 7 G 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.294 0.245 0.270 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.166 0.142 0.154 8 H 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.240 0.058 0.149 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.180 0.053 0.117 9 I 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.462 0.439 0.451 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.170 0.230 0.200 10 J 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.108 0.102 0.105 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.066 0.074 0.070 11 K 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.230 0.269 0.250 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.168 0.180 0.174 12 L 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.263 0.330 0.297 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.178 0.172 0.175 13 M 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.269 0.239 0.254 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.191 0.165 0.178 14 N 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.122 0.102 0.112 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.079 0.093 0.086 15 O 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.096 0.120 0.108 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.099 0.073 0.086 16 P 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.228 0.336 0.282 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.193 0.135 0.164 17 Q 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.659 0.578 0.619 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.220 0.246 0.233 18 R 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.162 0.241 0.202 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.102 0.098 0.100 19 S 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.511 0.539 0.525 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.239 0.266 0.253 20 T 1:10 0.071 0.056 0.064 0.011 0.085 0.657 0.772 0.715 1:5 0.067 0.062 0.065 0.004 0.072 0.374 0.409 0.392 Lampiran 10. Hasil uji ELISA penentuan alergenisitas ekstrak sampel Lampiran 10a. ekstrak sampel udang jerbung Serum Udang Sarkoplasma OD serum diuji rata- rata y OD kontrol negatif rata- rata x SD x+ 2SD Status Alergi A 0.528 0.371 0.120 0.117 0.004 0.125 Positif 0.213 0.114 B 0.187 0.137 0.120 0.117 0.004 0.125 Positif 0.087 0.114 C 0.162 0.133 0.082 0.079 0.005 0.088 Positif 0.104 0.075 D 0.072 0.072 0.082 0.079 0.005 0.088 Negatif 0.071 0.075 E 0.108 0.102 0.082 0.079 0.005 0.088 Positif 0.096 0.075 F 0.071 0.072 0.064 0.063 0.002 0.067 Positif 0.072 0.061 G 0.033 0.035 0.040 0.040 0.001 0.041 Negatif 0.036 0.039 H 0.040 0.042 0.040 0.040 0.001 0.041 Positif 0.044 0.039 I 0.161 0.165 0.125 0.110 0.021 0.152 Positif 0.169 0.095 J 0.121 0.116 0.178 0.195 0.023 0.241 Negatif 0.110 0.211 K 0.130 0.127 0.195 0.221 0.036 0.293 Negatif 0.123 0.246 L 0.992 0.935 0.098 0.086 0.017 0.120 Positif 0.878 0.074 M 0.182 0.168 0.178 0.157 0.030 0.216 Negatif 0.153 0.136 N 0.197 0.219 0.114 0.136 0.030 0.196 Positif 0.241 0.157 O 0.242 0.232 0.210 0.237 0.038 0.313 Negatif 0.221 0.264 P 0.291 0.293 0.181 0.178 0.005 0.187 Positif 0.294 0.174 Q 0.183 0.184 0.111 0.113 0.002 0.117 Positif 0.185 0.114 R 0.197 0.174 0.187 0.162 0.036 0.234 Negatif 0.151 0.136 S 0.126 0.155 0.195 0.221 0.036 0.293 Negatif 0.183 0.246 T 0.124 0.112 0.248 0.209 0.055 0.319 Negatif 0.099 0.170 Lampiran 10a. Lanjutan Serum Udang Miofibril OD serum diuji rata- rata y OD kontrol negatif rata- rata x SD x+ 2SD Status Alergi A 0.652 0.490 0.139 0.139 0.001 0.140 Positif 0.328 0.138 B 0.225 0.177 0.139 0.139 0.001 0.140 Positif 0.128 0.138 C .145 0.126 0.106 0.106 0.106 0.318 Negatif 0.106 0.097 D 0.112 0.115 0.106 0.102 0.006 0.114 Positif 0.117 0.097 E 0.113 0.118 0.106 0.102 0.006 0.114 Positif 0.123 0.097 F 0.090 0.092 0.091 0.093 0.002 0.097 Negatif 0.093 0.094 G 0.039 0.040 0.040 0.042 0.003 0.048 Negatif 0.041 0.044 H 0.068 0.055 0.040 0.042 0.003 0.048 Positif 0.041 0.044 I 0.208 0.205 0.165 0.151 0.020 0.191 Positif 0.201 0.137 J 0.176 0.184 0.128 0.150 0.030 0.210 Negatif 0.191 0.171 K 0.234 0.217 0.185 0.187 0.003 0.193 Positif 0.200 0.189 L 1.661 1.681 0.154 0.132 0.032 0.195 Positif 1.701 0.109 M 0.192 0.172 0.151 0.142 0.013 0.167 Positif 0.151 0.133 N 0.660 0.710 0.184 0.194 0.013 0.220 Positif 0.760 0.203 O 0.331 0.304 0.309 0.283 0.037 0.357 Negatif 0.276 0.257 P 0.758 0.632 0.256 0.232 0.035 0.301 Positif 0.505 0.207 Q 0.150 0.151 0.149 0.151 0.003 0.157 Negatif 0.151 0.153 R 0.175 0.166 0.162 0.158 0.006 0.169 Negatif 0.156 0.154 S 0.181 0.187 0.185 0.187 0.003 0.193 Negatif 0.192 0.189 T 0.228 0.235 0.118 0.146 0.040 0.225 Positif 0.242 0.174 Lampiran 10b. ekstrak sampel Ikan tongkol Serum Tongkol Sarkoplasma OD serum diuji rata- rata y OD kontrol negatif rata- rata x SD x+ 2SD Status Alergi A 0.733 0.546 0.081 0.080 0.002 0.084 Positif 0.359 0.078 B 0.175 0.132 0.081 0.080 0.002 0.084 Positif 0.089 0.078 C 0.115 0.096 0.071 0.077 0.008 0.092 Positif 0.076 0.082 D 0.076 0.075 0.071 0.077 0.008 0.092 Negatif 0.074 0.082 E 0.042 0.040 0.047 0.044 0.005 0.053 Negatif 0.038 0.040 F 0.078 0.084 0.077 0.076 0.002 0.080 Positif 0.089 0.074 G 0.038 0.039 0.047 0.044 0.005 0.053 Negatif 0.040 0.040 H 0.101 0.102 0.047 0.044 0.005 0.053 Positif 0.103 0.040 I 0.132 0.124 0.067 0.074 0.010 0.094 Positif 0.115 0.081 J 0.079 0.088 0.067 0.074 0.010 0.094 Negatif 0.097 0.081 K 0.166 0.157 0.111 0.118 0.010 0.138 Positif 0.147 0.125 L 0.080 0.084 0.083 0.080 0.004 0.088 Negatif 0.088 0.077 M 0.150 0.132 0.148 0.139 0.013 0.165 Negatif 0.113 0.129 N 0.165 0.172 0.183 0.155 0.040 0.235 Negatif 0.179 0.126 O 0.247 0.219 0.235 0.207 0.040 0.287 Negatif 0.191 0.178 P 0.230 0.208 0.218 0.200 0.026 0.252 Negatif 0.186 0.181 Q 0.152 0.143 0.157 0.152 0.007 0.166 Negatif 0.133 0.147 R 0.161 0.147 0.173 0.166 0.010 0.186 Negatif 0.133 0.159 S 0.102 0.119 0.111 0.118 0.010 0.138 Negatif 0.135 0.125 T 0.065 0.078 0.069 0.080 0.016 0.111 Negatif 0.091 0.091 Lampiran 10b. Lanjutan Serum Tongkol Miofibril OD serum diuji rata- rata y OD kontrol negatif rata- rata x SD x+ 2SD Status Alergi A 0.697 0.537 0.072 0.072 0.001 0.073 Positif 0.376 0.071 B 0.171 0.141 0.072 0.072 0.001 0.073 Positif 0.111 0.071 C 0.115 0.093 0.066 0.070 0.006 0.081 Positif 0.071 0.074 D 0.060 0.059 0.066 0.070 0.006 0.081 Negatif 0.058 0.074 E 0.043 0.044 0.041 0.042 0.001 0.045 Negatif 0.044 0.043 F 0.079 0.076 0.091 0.080 0.016 0.111 Negatif 0.072 0.069 G 0.038 0.040 0.041 0.042 0.001 0.045 Negatif 0.042 0.043 H 0.093 0.093 0.041 0.042 0.001 0.045 Positif 0.093 0.043 I 0.067 0.065 0.060 0.072 0.017 0.106 Negatif 0.062 0.084 J 0.063 0.079 0.060 0.072 0.017 0.106 Negatif 0.095 0.084 K 0.123 0.114 0.099 0.099 0.000 0.099 Positif 0.104 0.099 L 0.090 0.093 0.071 0.070 0.002 0.074 Positif 0.096 0.068 M 0.136 0.125 0.145 0.136 0.013 0.161 Negatif 0.114 0.127 N 0.187 0.198 0.193 0.151 0.059 0.270 Negatif 0.208 0.109 O 0.245 0.206 0.229 0.207 0.032 0.270 Negatif 0.167 0.184 P 0.259 0.231 0.229 0.210 0.027 0.264 Negatif 0.202 0.191 Q 0.153 0.149 0.144 0.139 0.007 0.153 Negatif 0.144 0.134 R 0.237 0.232 0.208 0.216 0.011 0.237 Negatif 0.226 0.223 S 0.091 0.117 0.099 0.099 0.000 0.099 Positif 0.142 0.099 T 0.053 0.065 0.053 0.059 0.008 0.076 Negatif 0.077 0.065 Lampiran 10c. Ekstrak sampel kerang hijau Serum Kerang Sarkoplasma OD serum diuji rata- rata y OD kontrol negatif rata- rata x SD x+ 2SD Status Alergi A 0.679 0.525 0.097 0.108 0.016 0.139 Positif 0.371 0.119 B 0.218 0.163 0.097 0.108 0.016 0.139 Positif 0.108 0.119 C 0.117 0.101 0.071 0.079 0.011 0.100 Positif 0.084 0.086 D 0.065 0.066 0.071 0.079 0.011 0.100 Negatif 0.067 0.086 E 0.044 0.044 0.042 0.041 0.001 0.044 Negatif 0.043 0.040 F 0.089 0.103 0.072 0.073 0.001 0.074 Positif 0.116 0.073 G 0.045 0.047 0.042 0.041 0.001 0.044 Positif 0.048 0.040 H 0.039 0.039 0.042 0.041 0.001 0.044 Negatif 0.038 0.040 I 0.125 0.101 0.113 0.118 0.007 0.132 Negatif 0.076 0.123 J 0.075 0.087 0.113 0.118 0.007 0.132 Negatif 0.099 0.123 K 0.150 0.130 0.176 0.183 0.009 0.201 Negatif 0.110 0.189 L 0.246 0.235 0.085 0.080 0.007 0.094 Positif 0.223 0.075 M 0.122 0.118 0.110 0.118 0.011 0.139 Negatif 0.114 0.125 N 0.199 0.194 0.217 0.239 0.030 0.299 Negatif 0.189 0.260 O 0.281 0.231 0.210 0.204 0.008 0.221 Positif 0.180 0.198 P 0.293 0.280 0.224 0.207 0.024 0.255 Positif 0.266 0.190 Q 0.167 0.159 0.121 0.127 0.008 0.144 Positif 0.150 0.133 R 0.213 0.224 0.159 0.190 0.044 0.278 Negatif 0.234 0.221 S 0.317 0.289 0.176 0.183 0.009 0.201 Positif 0.260 0.189 T 0.054 0.054 0.056 0.055 0.001 0.058 Negatif 0.054 0.054 Lampiran 10c. Lanjutan Serum Kerang Miofibril OD serum diuji rata- rata y OD kontrol negatif rata- rata x SD x+ 2SD Status Alergi A 0.713 0.552 0.079 0.087 0.011 0.108 Positif 0.390 0.094 B 0.217 0.168 0.079 0.087 0.011 0.108 Positif 0.119 0.094 C 0.139 0.120 0.118 0.140 0.030 0.200 Negatif 0.100 0.161 D 0.086 0.084 0.118 0.140 0.030 0.200 Negatif 0.081 0.161 E 0.042 0.041 0.039 0.040 0.001 0.043 Negatif 0.039 0.041 F 0.111 0.113 0.112 0.108 0.006 0.120 Negatif 0.114 0.103 G 0.040 0.040 0.039 0.040 0.001 0.043 Negatif 0.040 0.041 H 0.036 0.037 0.039 0.040 0.001 0.043 Negatif 0.038 0.041 I 0.144 0.123 0.103 0.109 0.008 0.126 Negatif 0.102 0.115 J 0.096 0.110 0.093 0.094 0.001 0.097 Positif 0.123 0.095 K 0.239 0.251 0.175 0.182 0.010 0.202 Positif 0.262 0.189 L 0.756 0.738 0.088 0.086 0.004 0.093 Positif 0.719 0.083 M 0.154 0.170 0.176 0.188 0.016 0.220 Negatif 0.186 0.199 N 0.664 0.632 0.206 0.220 0.020 0.260 Positif 0.600 0.234 O 0.245 0.234 0.266 0.250 0.023 0.296 Negatif 0.222 0.233 P 0.505 0.464 0.277 0.313 0.051 0.415 Positif 0.423 0.349 Q 0.194 0.196 0.244 0.226 0.026 0.278 Negatif 0.197 0.207 R 0.222 0.261 0.197 0.223 0.037 0.297 Negatif 0.299 0.249 S 0.197 0.194 0.175 0.182 0.010 0.202 Negatif 0.191 0.189 T 0.059 0.0585 0.101 0.0915 0.013 0.118 Negatif 0.058 0.082 Lampiran 11. Hasil uji imunoblotting Lampiran 11a. Uji imunoblotting serum A dan B Marker standar Pita ke- Jenis protein Jarak pergerakan cm BM kDa RF Log BM 1 Phosporilase- β 3.78 97 0.25 1.99 2 albumin 5.59 66 0.37 1.82 3 ovalbumin 8.22 45 0.55 1.65 4 carbonic anhidrase 11.91 30 0.79 1.48 5 Tripsin Inhibitor 13.94 20 0.93 1.30 Range 15.01 Lampiran 11a. Lanjutan Serum A Jenis protein Pita ke- Jarak pergerakan cm RF Log BM BM kDa Kerang miofibril 1 3.60 0.2395 1.9713 93.61 Tongkol sarkoplasma 1 7.30 0.4863 1.7358 54.43 Udang sarkoplasma 1 7.00 0.4663 1.7549 56.87 Udang miofibril 1 9.60 0.6396 1.5896 38.86 Range 15.01 Serum B Jenis protein Pita ke- Jarak pergerakan cm RF Log BM BM kDa Udang sarkoplasma 1 7.31 0.4870 1.7351 54.34 Udang miofibril 1 7.6 0.5063 1.7167 52.08 2 9.69 0.6456 1.5838 38.36 Range 15.01 Lampiran 11b. Uji imunoblotting serum H, M dan Q Marker standar Pita ke- Jenis protein BM kDa Log BM Jarak pergerakan cm Rf 1 β-galactosidase 116 2.064458 2.78 0.174404 2 BSA 66.2 1.820858 5.11 0.320577 3 Ovalbumin 45 1.653213 7.67 0.481179 4 Lactate dehydrogenase 35 1.544068 9.93 0.622961 5 Rease Bsp981 25 1.39794 12.41 0.778545 6 β-lactoglobulin 18.4 1.264818 13.99 0.877666 Range 15.94 Mk Sk Mu Su Mt St Mk Sk Mu Su Mt St Mk Sk Mu Su Mt St L P H Lampiran 11b. Lanjutan Serum H Jenis protein Pita ke- Jarak pergerakan cm RF Log BM BM kDa Udang sarkoplasma 1 4.39 0.277 1.909 81.16 2 5.43 0.341 1.840 69.17 Udang miofibril 1 9.12 0.570 1.593 39.17 Range 15.94 Serum P Jenis protein Pita ke- Jarak pergerakan cm RF Log BM BM kDa Udang sarkoplasma 1 10.09 0.633 1.525 33.50 2 10.68 0.670 1.485 30.56 Udang miofibril 1 4.15 0.261 1.927 84.46 2 4.61 0.289 1.896 78.70 3 9.08 0.570 1.593 39.19 4 10.19 0.639 1.518 32.96 5 10.82 0.679 1.475 29.88 Tongkol miofibril 1 9.17 0.575 1.587 38.64 Kerang sarkoplasma 1 10.015 0.628 1.530 33.87 2 10.19 0.639 1.518 32.96 3 10.83 0.679 1.475 29.83 4 11.101 0.696 1.456 28.60 Kerang miofibril 1 3.5 0.220 1.971 93.53 2 10.19 0.639 1.518 32.96 3 10.83 0.679 1.475 29.83 Lampiran 11b. Lanjutan Serum L Jenis protein Pita ke- Jarak pergerakan cm RF Log BM BM kDa Udang sarkoplasma 1 4.15 0.260 1.927 84.51 2 4.6 0.289 1.896 78.79 3 5.14 0.322 1.860 72.43 4 5.98 0.375 1.803 63.53 5 7.01 0.440 1.734 54.15 6 8.93 0.560 1.604 40.14 7 10.67 0.670 1.485 30.57 8 11.30 0.709 1.443 27.73 Udang miofibril 1 2.61 0.164 2.031 107.45 2 4.15 0.260 1.927 84.51 3 4.60 0.289 1.896 78.79 4 7.22 0.453 1.719 52.37 5 8.65 0.542 1.623 41.93 6 9.08 0.570 1.593 39.19 7 10.19 0.639 1.518 32.95 8 10.82 0.679 1.475 29.88 9 11.20 0.703 1.450 28.16 10 13.59 0.853 1.288 19.40 11 14.05 0.881 1.257 18.06 12 15.17 0.951 1.181 15.18 Tongkol sarkoplasma 1 3.62 0.227 1.963 91.82 2 9.51 0.597 1.564 36.65 3 11.04 0.693 1.460 28.86 4 12.11 0.760 1.388 24.43 5 13.53 0.849 1.292 19.57 Tongkol miofibril 1 10.82 0.679 1.475 29.88 2 11.2 0.703 1.450 28.16 3 11.3 0.709 1.443 27.72 Serum L Lanjutan Jenis protein Pita ke- Jarak pergerakan cm RF Log BM BM kDa Kerang sarkoplasma 1 4.661 0.292 1.892 78.04 2 5.14 0.322 1.860 72.43 3 6.405 0.402 1.774 59.46 4 10.021 0.629 1.529 33.84 5 10.82 0.679 1.475 29.88 6 11.098 0.696 1.457 28.61 Kerang miofibril 1 3.502 0.220 1.971 93.50 2 10.82 0.679 1.475 29.88 3 11.098 0.696 1.457 28.61 Range 15.94 ABSTRACT DIAN PURBASARI. Isolation and Characterization of Protein from Frigate Mackerel Fish Auxis thazard, Green Mussel Perna viridis and White Shrimp Penaeus merguensis for Production of Isolate Allergen. Under direction of FRANSISKA RUNGKAT- ZAKARIA and DAHRUL SYAH. Seafoods including fish, crustaceans and shellfish play an important role in human nutrition. However, it is also recognised as an important cause of food allergies, especially in coastal countries, including Indonesia. Treatments of these diseases still rely on avoiding the sources of the alergens, however it can also cause malnutrition which is also dangerous to health. To determine the specific food protein causing allergic reactions, cutie test was performed using isolate food protein. Until the present time, Indonesia still imports kits containing isolate proteins for food allergy diagnosis, therefore effort to locally produce the kit will reduce health cost for patients with allergic diseases. The objective of this study was to produce seafoods protein extract that is potential to be used as isolate of allergens for food allergy diagnosis. Two extract sarcoplasmic and myofibril protein were obtained from fish, shrimp and mussel by extraction in phosphate buffer with diference ionic strength Protein profile were then detected by means of sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE. IgE binding pattern was analyzed by using ELISA and immunoblotting using sera from 20 respondents with histories of food allergy. The result of the study showed that samples of seafood extract protein consist of several protein with various molecular weight in the range about 14 to 143 kDa. The component were identified as tropomyosin 34-38 kDa, parvalbumin ~12 kDa, myosin light chain ~17.5 kDa and arginin kinase 40 kDa which are major allergens in seafoods. Further analysis with ELISA showed that the seafood protein extracts contained several IgE-binding proteins. Immunoblot of three extract samples from seafoods showed that components identified as allergens to each allergic subject have different molecular weight. The results demonstrated that crude extract could be directly used as isolate allergen for diagnostic test allergy skin prick test without isolating the major allergen components. Key word : seafoods, allergen, food allergy, SDS-PAGE, immunoblotting, ELISA RINGKASAN DIAN PURBASARI. Isolasi dan Karakterisasi Protein Ikan Tongkol Auxis thazard, Kerang Hijau Perna viridis dan Udang Jerbung Penaeus merguiensis untuk Pembuatan Isolat Alergen. Dibimbing oleh FRANSISKA RUNGKAT- ZAKARIA dan DAHRUL SYAH. Alergi pangan merupakan reaksi antibodi imunoglobulin E IgE terhadap protein dalam bahan pangan yang disebut alergen. Diantara pangan penyebab alergi, makanan laut dikenal sebagai penyebab penting alergi pangan. Sampai saat ini cara terbaik untuk mengatasi alergi pangan adalah dengan menghindari makanan yang dicurigai menimbulkan alergi yang dapat merugikan kesehatan dan mengurangi cita rasa suatu jenis pangan. Oleh karena itu diperlukan suatu diagnosis alergi untuk memastikan jenis pangan penyebab alergi, salah satunya yaitu dengan uji tusuk kulit skin prick test. Uji ini menggunakan isolat alergen yang saat ini masih berasal dari impor. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan ekstrak protein dari ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung yang berpotensi sebagai isolat alergen untuk uji diagnosis alergi. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap, pertama yaitu isolasi protein sampel, dalam bentuk ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril. Tahap selanjutnya yaitu karakterisasi ekstrak protein dengan SDS-PAGE dan penentuan alergenisitas masing-masing ekstrak dengan metode ELISA dan immunoblotting menggunakan 20 serum subyek penderita alergi. Hasil analisis kadar protein dengan metode Bradford menunjukkan bahwa kadar protein sarkoplasma sampel udang, ikan tongkol dan kerang hijau berturut- turut adalah 1.154 mgml, 1.269 mgml dan 0.691 mgml. Sedangkan kadar protein adalah 0.627 mgml, 0.878 mgml dan 0.176 mgml. Berdasarkan hasil elektroforesis SDS-PAGE tiga ekstrak protein sampel diketahui bahwa komponen penyusunnya memiliki berat molekul berkisar dari 14 – 143 kDa, yang diidentifikasi beberapa komponen seperti tropomiosin 34-38 kDa, parvalbumin ~12 kDa, myosin light chain ~17.5 kDa dan arginin kinase 40 kDa yang merupakan alergen utama pada ikan, kerang dan udang. Uji alergenisitas dengan metode ELISA ekstrak protein dari ketiga sampel terhadap 20 serum subyek menunjukkan hasil yang sesuai dengan sejarah medis alergi tiap-tiap subyek. Kemampuan ekstrak protein baik fraksi sarkoplasma dan miofibril dari ketiga sampel untuk mendeteksi IgE spesifik pada serum penderita alergi makanan laut menunjukkan bahwa ekstrak ini berpotensi untuk digunakan sebagai isolat alergen dalam diagnosis alergi, seperti uji tusuk atau SPT skin prick test. Berdasarkan immunoblotting ekstrak protein ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung memperlihatkan adanya fraksi protein yang bersifat alergenik terhadap 5 serum subyek alergi A, B, H, L dan P. Fraksi protein yang menyebabkan alergi pada tiap-tiap individu berbeda-beda. Sehingga untuk tujuan diagnosis ekstrak dapat digunakan langsung tanpa harus mengisolasi komponen alergennya. Kata kunci : alergi makanan laut, alergen, SDS-PAGE, ELISA, immunoblotting

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Alergi pangan merupakan reaksi yang merugikan dari makanan yang didasarkan pada mekanisme imonologi Houben dan Penninks 1996. Dalam beberapa tahun terakhir, angka kejadian alergi pangan terus meningkat tajam baik di dalam negeri maupun luar negeri. World Allergy Organization WAO menyebutkan 22 penduduk dunia menderita alergi dan terus meningkat setiap tahun Candra et al. 2011. Jumlah kasus alergi pangan paling banyak pada bayi dan anak-anak yaitu berkisar antara 6-8 dan pada orang dewasa sekitar 1-2 Sampson 2005. Kasus alergi pangan di Indonesia menunjukkan jumlah yang belum pasti namun selalu meningkat tiap tahunnya Noverina 2008. Timbulnya alergi pangan disebabkan adanya senyawa penyebab alergi atau lebih dikenal dengan alergen. Alergen pangan berupa protein yang tidak rusak pada saat proses pemasakan dan saat berada di keasaman lambung. Secara struktural protein makanan alergen tidak sama dengan struktur protein tubuh manusia sehingga dideteksi oleh sistem imun tubuh sebagai protein asing. Akibatnya alergen dapat masuk ke dalam tubuh melalui peredaran darah mencapai organ yang menjadi tergetnya sehingga menginduksi respon imun dan menimbulkan reaksi alergi. Gejala reaksi alergi dapat terlihat sebagai timbulnya gangguan kulit berupa bercak-bercak merah yang gatal pada permukaan kulit, gangguan saluran pencernaan berupa diare dan muntah, sesak nafas sampai syok anafilaksi yang fatal dan gangguan rongga mulut Hamada et al. 2003. Pada dasarnya semua makanan dapat menimbulkan reaksi alergi, yang membedakan hanya kadar protein di dalamnya dan kondisi tubuh seseorang dalam menerima pasokan protein tersebut. Umumnya makanan yang sering menimbulkan reaksi alergi adalah makanan yang mengandung protein tinggi yang sayangnya merupakan makanan sumber protein yang penting bagi kesehatan. Sekitar 90 reaksi alergi pangan disebabkan oleh kacang tanah, susu, telur ayam, kedelai, ikan, kerang dan gandum FAAN 2010. Ikan dan makanan laut memiliki peranan penting dalam gizi manusia. Makanan laut merupakan sumber protein yang sangat berharga dan mengandung sejumlah besar asam lemak tak jenuh jamak PUFA dan vitamin larut lemak. Namun, makanan laut juga merupakan salah satu jenis pangan penyebab terpenting timbulnya alergi, terutama di negara-negara yang mayoritas penduduknya bergantung pada sektor perikanan dan dimana ikan menjadi konsumsi andalannya Samartin et al. 2001. Makanan laut ditemukan sebagai alergen pangan terpenting kedua setelah telur pada pasien penderita alergi Lopata dan Potter 2000. Tiga jenis makanan laut yang dapat memicu alergi yaitu ikan, crustacea kepiting, lobster, udang dan moluska seperti kerang, tiram, remis dan cumi FAAN 2010. Hasil survei di Amerika Serikat menunjukkan bahwa 1,9 dari total penduduk memiliki alergi terhadap kelompok udang dan kerang-kerangan, dan sebanyak 0,4 dari total penduduk memiliki alergi terhadap ikan Sicherer et al. 2004. Di Malaysia, ikan dan udang-udangan merupakan penyebab alergi pangan yang paling umum pada penderita alergi asma dan rhinitis Shanaz et al. 2001. Sampai saat ini upaya mengatasi alergi yang selama ini telah terbukti dan banyak dilakukan adalah dengan menghindari makanan yang diduga menimbulkan alergi Sicherer dan Sampson 2009. Namun ternyata tindakan ini dapat merugikan kesehatan karena beresiko kekurangan gizi dan kurang variasi dalam menu makanan, selain itu juga dapat mengurangi kenikmatan cita rasa suatu jenis pangan. Oleh karena itu untuk memastikan jenis bahan pangan penyebab alergi diperlukan suatu diagnosis alergi. Diagnosis yang sering dilakukan adalah dengan uji kulit menggunakan isolat protein alergen pangan. Di Indonesia saat ini tempat untuk melakukan uji ini masih belum banyak ditemukan. Hal ini disebabkan karena isolat protein alergen yang saat ini digunakan oleh para dokter ahli alergologi di Indonesia masih berasal dari hasil impor sehingga biaya uji ini masih mahal Candra et al. 2011. Pemikiran tersebut mendasari penelitian untuk mengetahui potensi protein makanan laut asal Indonesia sebagai isolat alergen, utamanya jenis ikan tongkol Auxis thazard, kerang hijau Perna viridis dan udang jerbung Penaeus merguiensis. Isolat alergen yang dapat diproduksi di dalam negeri menyebabkan biaya uji alergi dapat lebih murah dan dapat mudah dilakukan. Ketiga jenis produk laut tersebut dipilih karena selain dihasilkan melimpah, juga sering dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia.

1.2. Perumusan Masalah

Alergi yang timbul karena adanya reaksi penyimpangan adverse reaction yang melibatkan sistem imun dan komponen pangan berupa protein, disebut dengan alergi pangan. Terdapat lebih dari 160 jenis pangan yang dapat menyebabkan reaksi alergi. Salah satu penyebab utama alergi pangan adalah pangan yang berasal dari hasil laut yaitu ikan, kepiting, kerang, udang dan lobster. Sampai saat ini belum ada obat khusus untuk mengatasi alergi pangan. Tindakan pencegahan terbaik yaitu dengan menghindari sumber pangan penyebabnya, namun hal ini juga dapat bersifat merugikan karena pembatasan keragaman jenis pangan dapat berdampak pada kondisi kurang gizi protein dan berkurangnya kenikmatan cita rasa suatu jenis pangan. Diagnosis alergi pangan dibuat berdasarkan diagnosa klinis, yaitu anamnesa mengetahui riwayat penyakit penderita dan pemeriksaan kejadian alergi yang terjadi. Pemeriksaan yang dilakukan banyak dan beragam, baik dengan cara yang ilmiah hingga cara alternatif, mulai yang dari yang sederhana hingga yang canggih. Diantaranya adalah uji kulit alergi, yaitu suatu uji yang diterapkan secara subkutanus dengan menggunakan isolat protein alergen dari berbagai jenis pangan. Saat ini isolat protein alergen yang digunakan di Indonesia oleh para dokter ahli alergologi masih berasal dari hasil impor, sehingga diperlukan penyediaan protein isolat lokal.

1.3. Tujuan Penelitian

Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menghasilkan ekstrak protein dari makanan laut Indonesia yang berpotensi sebagai isolat alergen dan dapat digunakan untuk diagnosis alergi pangan. Sedangkan tujuan khusus penelitian ini adalah : 1. Melakukan ekstraksi protein sarkoplasma dan miofibril ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung 2. Mengkarakterisasi protein sarkoplasma dan miofibril ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung dengan elektroforesis SDS PAGE 3. Mengetahui kandungan IgE serum subyek penderita alergi pangan dengan uji ELISA 4. Menguji coba alergenisitas ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung dengan menggunakan serum subyek penderita alergi pangan dengan teknik ELISA dan immunoblotting.

1.4. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah : 1. Memberikan informasi tentang metode ekstraksi protein sarkoplasma dan miofibril dari makanan laut ikan, udang dan kerang. 2. Memberikan informasi ilmiah tentang sifat alergenisitas 3 jenis bahan pangan yaitu ikan, udang dan kerang-kerangan. 3. Menghasilkan ekstrak protein produk laut yang berpotensi sebagai isolat alergen yang dapat diaplikasikan untuk diagnosis alergi terhadap makanan laut.

1.5. Hipotesis

1. Terdapat protein alergen dalam ekstrak protein fraksi sarkoplasma dan miofibril ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung. 2. Komponen yang terdapat dalam kedua fraksi ekstrak protein ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung dapat berikatan spesifik dengan IgE dari 20 serum subyek alergi. 3. Jenis komponen yang ada dalam masing-masing ekstrak protein yang dapat menyebabkan alergi pada setiap orang berbeda-beda. 4. Ekstrak protein yang dihasilkan dapat digunakan sebagai isolat alergen dalam bentuk crude.

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Alergi Istilah alergi dikemukakan pertama kali oleh von Pirquet pada tahun 1906. Alergi dikenal sebagai reaksi hipersensitivitas dan dapat diartikan sebagai reaksi imunologi terhadap antigen secara tidak wajar atau tidak tepat pada seseorang yang sebelumnya pernah terpapar dengan antigen bersangkutan Kresno 2001. Secara garis besar, reaksi alergi dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu reaksi tipe cepat immediate hypersensitivity dan tipe lambat delayed type hypersensitivity . Reaksi alergi tipe cepat dimediasi oleh sistem imun humoral humoral-mediated yang menunjukkan gejala secara cepat dalam hitungan menit atau jam setelah tubuh terpapar oleh antigen. Reaksi tipe lambat dimediasi oleh sel cell-mediated dan gejala yang ditimbulkan muncul setelah beberapa hari terpapar oleh antigen. Berdasarkan mekanisme terjadinya reaksi, alergi terdiri atas empat jenis yaitu tipe I IgE-mediated hypersensitivity, tipe II Antibody- mediated cytotoxic hypersensitivity , tipe III Immune complex-mediated hypersensitivity dan tipe IV Delayed-type hypersensitivity, DTH. Tipe I hingga III termasuk reaksi alergi tipe cepat, sedangkan tipe IV termasuk reaksi alergi tipe lambat Kuby 2007. Mekanisme umum terjadinya beberapa tipe alergi dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1. Empat tipe reaksi alergi Kuby 2007 Reaksi alergi tipe I terjadi dengan cara alergen memicu sel limfosit B untuk berubah menjadi sel plasma dan mengeluarkan IgE. IgE ini kemudian terikat dengan reseptornya pada permukaan sel mastosit dan sel basofil darah. Hal ini menyebabkan sel mastosit dan basofil mengalami degranulasi dan mengeluarkan efektor. Reaksi alergi tipe II melibatkan antibodi untuk merusak sel asing. Mekanisme seperti ini dijalankan dengan mengaktifkan sistem komplemen dan membentuk lubang pada sel asing. Mekanisme ini juga dapat dijalankan dengan melibatkan sel sitotoksik dan antiobdi untuk menghancurkan sel asing tersebut. Pada reaksi alergi tipe III, kompleks imun yang dibentuk oleh antigen dengan antibodi menjadikan sel fagosit mengenali kompleks imun ini dan menghancurkan kompleks tersebut. Namun jika kompleks imun yang dibentuk sangat banyak, hal ini dapat membahayakan jaringan tubuh. Reaksi alergi tipe IV berlangsung dengan melibatkan pelepasan sitokin. Ketika sel T pembantu mengenali antigen, sel ini akan mengeluarkan sitokin yang dapat menginduksi terjadinya reaksi peradangan yang dikenal dengan reaksi alergi yang tertunda. Reaksi ini ditandai dengan adanya sel penyebab radang seperti sel makrofag dalam jumlah besar Kuby 2007.

2.1.1. Alergi Pangan

Alergi yang sering timbul karena konsumsi bahan pangan disebut dengan alergi pangan. Alergi pangan merupakan reaksi yang merugikan dari makanan yang didasarkan pada mekanisme imonologi Houben dan Penninks 1996. Timbulnya reaksi alergi pangan disebabkan di dalam bahan pangan tersebut terdapat senyawa penyebab alergi atau lebih dikenal dengan alergen. Alergen dalam makanan dapat berupa protein, glikoprotein atau polipeptida dengan berat molekul lebih dari 18.000 dalton, tahan panas dan tahan enzim proteolitik Hasyimi et al. 1992. Reaksi alergi pangan merupakan reaksi hipersensitivitas yang diperantarai oleh imunoglobulin E IgE dan termasuk dalam reaksi alergi tipe I Adelman et al . 2002. Reaksi alergi tipe I diawali dengan tahap pengenalan, yaitu saat protein alergenik kontak dengan tubuh untuk pertama kalinya. Protein alergenik tersebut kemudian difagosit dan dihancurkan oleh makrofag menjadi fragmen-fragmen peptida. Fragmen-fragmen ini kemudian dipresentasikan oleh APC Antigen- Presenting Cell melalui MHC II Major Histocompatibility Complex II. Kemudian sel T helper 1 Th 1 akan menempel pada kompleks MHC II-fragmen peptida, sehingga sel Th 1 mensekresikan sitokin yang merangsang proliferasi dan diferensiasi sel B menjadi sel plasma. Sel plasma inilah yang menghasilkan sel memori dan IgE. IgE merupakan salah satu anggota imunoglobulin darah yang berperan dalam reaksi alergi dan infeksi parasit. Molekul IgE yang dihasilkan ini akan terikat pada reseptor spesifik Fc pada sel mastosit dan basofil pada darah. Pada pemaparan yang kedua, alergen akan membentuk ikatan dengan IgE yang menancap pada permukaan sel mastosit dan basofil. Setiap alergen harus dapat mengikat dua atau lebih molekul IgE cross linking. Ikatan tersebut menyebabkan terjadinya reaksi-reaksi biokimia, sehingga terjadi degranulasi dalam sel mastosit dan basofil. Hasil degranulasi adalah terlepasnya mediator alergi yang sebelumnya telah ada dalam sel seperti histamin, serotonin, kinin, prostaglandin dan leukotrien. Histamin yang dilepaskan dapat memperlebar pembuluh darah arteri dan pembuluh darah kapiler, meningkatkan permeabilitas pembuluh kapiler, dan mempersempit aliran darah pada saluran pernafasan. Mekanisme umum terjadinya reaksi hipersensitivitas tipe I dapat dilihat pada Gambar 2 Kuby 2007. Gambar 2. Mekanisme umum reaksi hipersensitif tipe I Kuby 2007. Reaksi alergi terhadap susu, kacang-kacangan, ikan, kerang-kerangan, gandum dan kedelai merupakan alergi pangan yang signifikan terjadi di Amerika Serikat, namun sejumlah makanan lain juga dapat menyebabkan respon alergi Sicherer dan Sampson 2009. Reaksi hipersensitivitas yang timbul karena konsumsi kerang-kerangan merupakan salah satu bentuk alergi pangan yang serius. Di Amerika Serikat, lebih dari enam juta orang beresiko memiliki respon hipersensitif setelah konsumsi kerang Wild dan Lehrer 2005. Diantara kerang- kerangan, kepiting diasumsikan menjadi penyebab utama reaksi hipersensitif di China, terdapat lebih dari 600 jenis kepiting di China. Hasil survey terhadap status alergi pangan pelajar China mengindikasikan bahwa sekitar 6 subyek dalam kelompok usia 15-24 tahun menderita sedikitnya menderita alergi pangan, dan alergenik pangan utamanya adalah makanan laut, termasuk kepiting Lu et al. 2005.

2.1.2. Alergen dalam makanan

Istilah alergen secara sepesifik mengacu pada antigen nonparasit yang mampu menstimulasi respon hipersensitivitas tipe I pada individu atopik. Beberapa individu yang cinderung lebih mudah mengalami reaksi hipersensitivitas tipe I jika terpapar oleh antigen atau alergen, disebut dengan atopik. Respon abnormal IgE pada individu atopik sebagian karena genetik, yang diturunkan dari keluarga Kuby 2007. Makanan tersusun dari karbohidrat, protein dan lemak. Alergen yang utama dalam makanan merupakan protein, glikoprotein atau polipeptida dengan berat molekul yang berkisar dari 10.000 dan 60.000 D, larut air, tahan panas dan tahan enzim proteolitik Adelman et al. 2002. Alergen pangan biasanya hanya sebagian kecil dari keseluruhan protein yang terdapat dalam makanan. Protein dari jenis makanan seperti telur, susu sapi, kacang-kacangan, gandum, makanan laut ikan, kerang-kerangan, lobster dan udang dan jenis makanan lain seperti kentang, apel, kacang polong dapat menjadi penyebab terjadinya alergi atau reaksi hipersensitif tipe I Kuby 2007. Protein alergen pada tiap individu berbeda-beda. Perbedaan ini disebabkan karena reaksi alergi merupakan interaksi antara protein dan sistem imun yang sulit untuk diprediksi. Alergenisitas suatu protein ditentukan oleh epitop yang dimilikinya Huby et al. 2000. Epitop merupakan bagian molekul alergen yang berikatan dengan antibodi IgE dan menentukan spesifitas reaksi protein alergen dan antibodi IgE. Jumlah epitop pada satu molekul alergen berbeda dengan jumlah epitop pada alergen yang lain Kresno 2001. Berbagai penelitian membuktikan bahwa suatu alergen sedikitnya harus memiliki 2 epitop, yang masing-masing memiliki sekitar 15 residu asam amino. Hal ini menunjukkan bahwa protein alergen minimal mengandung sekitar 30 residu asam amino BM sekitar 3 kDa. Sebagai contoh, alergen kacang Ara h 1 dan Ara h 3 memiliki sedikitnya 23 dan 4 epitop, sedangkan alergen kedelai Gly m Bd memiliki 16 epitop Huby et al. 2000. Suatu alergen yang mampu bereaksi dengan 50 IgE serum individu penderita alergi disebut dengan alergen mayor. Alergen minor hanya dapat bereaksi dengan 10 IgE serum atau bahkan tidak begitu kuat untuk menyebabkan alergi. Contoh alergen mayor antara lain β-laktalbumin, kasein, α- laktalbumin susu dan antigen I, antigen II pada udang. Laktoferin, laktoperoksidase, alkalifosfatase dan katalase susu merupakan jenis protein yang tergolong sebagai alergen minor Bush dan Hefle 1996. Protein alergen pertama masuk ke dalam tubuh melalui intestinal. Dalam hal ini, protein alergen memiliki ketahanan terhadap kondisi asam dalam lambung serta enzim protease dalam saluran pencernaan seperti tripsin, kimotripsin dan pepsin. Hal tersebut dikarenakan sebagian besar alergen mempunyai epitop kontinyu yang dapat tahan terhadap panas dan sistem pencernaan seperti garam empedu, asam dan enzim proteolitik. Namun demikian, jika saluran pencernaan sesorang dalam kondisi sehat dan dapat mencerna makanan dengan sempurna, alergen yang merupakan peptida ini tidak akan terserap oleh usus halus sehingga tidak akan menyebabkan alergi walaupun secara genentik orang tersebut memiliki riwayat alergi. Alergen dapat terserap jika pada dinding usus halus seseorang terdapat lubang yang memungkinkan alergen masuk. Pembentukan lubang ini dapat disebabkan oleh cacing, bakteri atau bahan kimia. Oleh karena itu, kelainan genetik saja tidak cukup untuk menjelaskan terjadinya reaksi alergi. ada kecinderungan bahwa faktor lingkungan juga mempunyai pengaruh penting dalam reaksi hipersensitivitas terhadap protein alergen Garn dan Renz 2007.

2.1.3. Deteksi Alergi

Alergi tipe I umumnya dapat dideteksi dengan melalui uji tusuk kulit. Uji ini dilakukan dengan menggunakan ekstrak alergen dan cairan kontrol diteteskan pada permukaan volar lengan bawah. Bagian superfisial kulit ditusuk menggunakan jarum khusus tanpa berdarah. Untuk setiap alergen harus digunakan jarum yang berbeda untuk menghindari tercampurnya cairan uji. Dalam melakukan uji tusuk kulit, sebagai kontrol positif dipakai histamin dan untuk kontrol negatif dipakai bahan pelarut Mygind et al. 1994. Tes dibaca setelah 15 menit, reaksi positif dinyatakan adanya kemerahan dan bentol pada kontrol positif histamin dengan minimal diameter 3 mm lebih besar dibanding dengan kontrol negatif. Keunggulan uji tusuk kulit adalah sederhana, pembacaan dapat dilakukan dengan cepat, mempunyai sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi serta dapat menguji sejumlah besar alergen sekaligus Rusznak Davies 1998; Jarvis Burney 2004. Uji lain yang dapat digunakan untuk diagnosa alergi adalah uji oral double blind challange . Uji ini dilakukan untuk memastikan makanan penyebab alergi pada pasien dalam keadaan puasa. Metode dilakukan dengan cara pemberian makanan yang mengandung alergen dalam bentuk kapsul dengan dosis yang dinaikkan secara bertahap, lalu ditunggu reaksinya dengan interval 15-30 menit. Pengujian biasanya membutuhkan waktu 4-8 jam. Uji ini membutuhkan tenaga ahli yang terampil dan berpengalaman Groce 2007. Selain itu, juga masih banyak uji yang dapat dilakukan untuk mengetahui penyebab alergi diantaranya yaitu analisa total IgE, analisis IgE spesifik, uji degranulasi basofil dan mastosit, uji pelepasan histamin dan uji permeabilitas intestinal.

2.2. Makanan Laut Penyebab Alergi

Di seluruh dunia, makanan laut berupa ikan, udang dan kerang-kerangan memiliki peranan penting dalam zat gizi manusia. Namun, makanan laut juga merupakan alergen yang kuat pada individu yang sensitif dan menyebabkan reaksi alergi. Alergi pangan karena makanan laut paling mudah terdeteksi karena gejala yang ditimbulkan relatif cepat. Biasanya kurang dari 8 jam keluhan alergi sudah bisa dikenali. Jenis makanan laut yang sering mengakibatkan gangguan adalah jenis yang berukuran kecil seperti udang, cumi, kerang, kepiting dan sebagainya. Ikan laut yang agak besar seperti salmon, tuna dan sebagainya relatif lebih ringan. Klasifikasi makanan laut utama yang dapat menyebabkan reaksi alergi dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah ALLSA 2008. Tabel 1. Klasifikasi makanan laut penyebab alergi ALLSA 2008 Grup Kelas Spesies Mollusca Gastropoda Bivalvia Cephalopoda Abalone, Siput Tiram, Remis Cumi-cumi, Gurita Arthropoda Crustacea Lobster, Udang, Lobster air tawar crayfish Chordata Osteichthyes Condrichthyes Ikan Cod, Tuna, Salmon, Makerel Ikan hiu,cucut Kelompok crustacea dan moluska merupakan janis pangan yang paling sering menyebabkan reaksi hipersensitif yang diperantarai oleh antibodi IgE, yang menimbulkan gejala alergi berupa urtikaria gatal di kulit, angiodema, asma atau kombinasi dari beberapa gejala tersebut Motoyama et al. 2006. Penelitian Clark et al. 2004 menunjukkan bahwa alergen ikan laut dapat mengakibatkan terjadinya 10 reaksi anafilaksis. Sifat alergi dari protein ikan dipengaruhi oleh kondisi fisiologis lambung, terutama pada individu yang sensitif terhadap jenis pangan ini Untersmayr et al. 2005. Protein ikan berdasarkan kelarutannya dibagi menjadi 3 jenis yaitu protein sarkoplasma, protein miofibril dan protein stroma. Protein sarkoplasma berisi beberapa jenis protein yang larut air dan dapat diekstrak dengan larutan garam berkekuatan ion rendah. Protein miofibril merupakan protein yang dapat diekstrak dengan larutan garam dengan kekuatan ion tinggi. Protein stroma merupakan jenis protein yang tidak larut baik dalam larutan garam, asam maupun basa. Protein miofibril merupakan bagian terbesar dari protein ikan yaitu sekitar 66-77 dari total protein ikan. Protein sarkoplasma terdapat dalam jumlah sekitar 10 dari total protein ikan, sedangkan protein stroma berkisar antara 3-5. Kandungan protein sarkoplasma dalam daging ikan bervariasi tergantung jenis ikan. Pada umumnya ikan pelagik mempunyai kandungan sarkoplasma lebih besar daripada ikan demersal Suzuki 1981.

2.2.1. Ikan Tongkol

Ikan merupakan salah satu diantara delapan jenis pangan penyebab alergi dan menempati urutan kedua terpenting setelah telur Lopata dan Potter 2000. Beberapa jenis ikan terutama ikan laut yang paling umum menyebabkan alergi pangan diantaranya berasal dari famili Scombridae yaitu ikan tuna, tongkol, cakalang, tenggiri, kembung. Selain itu juga ikan teri, ikan cod, kerapu, marlin, salmon, sarden, hiu dan kakap CFIA 2010. Ikan tongkol merupakan salah satu famili Scombridae, bagian dari ikan konsumsi penting di Indonesia. Dapat tumbuh sampai 1 meter dengan berat maksimal 14 kg. merupakan ikan pelagis yang hidup di pantai sampai laut lepas dengan kedalaman 200 meter Kuncoro dan Wiharto 2009. Klasifikasi ikan tongkol Auxis thazard adalah sebagai berikut Saanin 1984 : Filum : Chordata Subfilum : Vertebrata Kelas : Teleostei Subkelas : Actinopterygi Ordo : Perciformes Subordo : Scombroidea Famili : Scombridae Genus : Auxis Spesies : Auxis thazard Komposisi protein daging putih ikan mackerel yang juga merupakan famili Scombridae terdiri dari 33-37 protein sarkoplasma, 59-61 protein miofibril dan 1-2 protein stroma Hashimoto et al. 1979. Hasil penelitian Benjakul et al. 2001 terhadap komposisi protein miofibril dari dua jenis ikan bigeye snapper Priacanthus tayenus dan Priacanthus macracanthus memberikan hasil yang mirip, yaitu berkisar antara 44-45 dari total protein. Hasil elektroforesis fraksi protein miofibril dari kedua jenis spesies memperlihatkan band protein yang merupakan miosin rantai panjang, aktin, troponin, tropomiosin dan juga miosin rantai panjang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jenis alergen mayor pada ikan cod Gadus callaria adalah parvalbumin dikenal sebagai Gad c1, merupakan suatu protein sarkoplasma yang berikatan dengan kalsium dengan berat molekul sekitar 12 kDa Elsayed dan Aas 1971 dalam Hamada et al. 2003. Selain itu juga diketahui adanya alergen minor pada beberapa jenis ikan lain melalui teknik immunoblotting dan salah satunya telah dimurnikan dan diidentifikasi sebagai kolagen Hamada et al. 2001.

2.2.2. Kerang Hijau

Kerang hijau merupakan salah satu jenis sumber daya laut yang memiliki nilai ekonomis penting. Kerang ini tergolong dalam filum Mollusca. Daging segar kerang hijau umumnya sangat lunak, berwarna putih atau oranye mengkilap dan berair. Presentase daging kerang hijau lebih besar dibandingkan dengan jenis kerang-kerangan lainnya, seperti kerang darah dan kerang bulu. Berikut ini adalah klasifikasi kerang hijau Perna viridis berdasarkan NIMPIS 2002 : Filum : Mollusca Kelas : Bivalvia Sub kelas : Pteriomorphia Ordo : Mytiloida Famili : Mytilidae Genus : Perna Spesies : Perna viridis Beberapa alergen dari moluska adalah Tod p 1 dalam cumi-cumi, Hal m1 dalam abalone, Cra g 1 dalam tiram telah dikarakterisasi dengan menggunakan teknik biokimia. Leung et al. 1996 menyatakan bahwa suatu protein 38 kDa diidentifikasi sebagai tropomiosin yang juga ditemukan sebagai alergen pada berbagai spesies moluska. Tropomiosin ditetapkan sebagai penyebab alergi utama dan merupakan alergen yang umum ditemukan pada penelitian alergen kerang. Tropomiosin dari beberapa spesies telah diklon dan disekuen dan epitop mayor yang berikatan dengan IgE telah diidentifikasi. Tropomiosin dikenal sebagai alergen yang menyebabkan reaksi silang yang terdapat pada otot dan sel-sel lain dari kerang tersebut Leung et al. 1996. Beberapa bivalvia terbukti memiliki minimal 2 bentuk tropomiosin, namun hanya salah satu bentuk yang ditemukan dalam spesies kerang M.galloprovincialis Fujinoki 2006 yang memiliki identitas 100 asam amino daripada kerang biru M.edulis Taylor 2008. Beberapa alergen selain tropomiosin telah ditemukan dalam spesies moluska lain namun belum teridentifikasi secara rinci. Alergen ini diusulkan sebagai hemosianin, miosin rantai panjang dan amilase Taylor 2008. Adanya alergen selain tropomiosin pada spesies moluska menunjukkan bahwa alergen lain juga mungkin ada dalam kerang juga. Serum pasien yang mempunyai alergi terhadap udang bereaksi juga dengan band kedua dari kerang hijau Asia P.viridis Leung et al. 1996.

2.2.3. Udang Jerbung

Salah satu spesies dari famili Penaeidae yang bernilai ekonomis tinggi dan tersebar luas hampir di seluruh Indonesia adalah udang jerbung Penaeus merguiensis . Seperti hewan laut lainnya, dua komponen yang dominan pada udang adalah air dan protein. Protein udang juga terdiri dari protein sarkoplasma, miofibril dan stroma Suzuki 1981. Penelitian Sriket et al. 2007 terhadap dua jenis udang Penaeus monodon dan Penaeus vannamei menunjukkan bahwa komponen protein utama adalah miofibril yang terdiri dari aktin dan myosin heavy chain MHC. Perbedaan kandungan protein miofbril, sarkoplasma dan stroma dari jenis udang putih P.vannamei dan udang P.monodon disebabkan karena perbedaan sifat dan karakteristik dari kedua jenis spesies udang tersebut. Udang jerbung memiliki klasifikasi sebagai berikut Racek dan Dall 1965 dalam Naamin et al. 1992 : Filum : Arthropoda Subfilum : Crustacea Kelas : Malacostraca Ordo : Decapoda Famili : Penaeidae Genus : Penaeus Spesies : Penaeus merguiensis Dari sejumlah pangan penyebab alergi, kelompok udang-udangan ditetapkan menjadi salah satu penyebab utama terjadinya alergi pangan yang dikarenakan semakin meningkatnya konsumsinya, terutama di negara-negara pesisir Lehrer et al. 2003. Udang merupakan satu diantara delapan sumber utama alergen pangan