Tempat dan Waktu Penelitian Alat dan Bahan Skrining Biotransformasi Berberin

17

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian

4.1.1 Tempat :

Penelitian Biotransformasi Berberin Oleh Jamur Endofit Dari Tumbuhan Akar Kuning Arcangelisia flava L. Merr: MENISPERMACEAE dilaksanakan di Laboratorium Fitokimia, Puslit Biologi LIPI Cibinong.

4.1.2 Waktu :

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2010 sampai dengan Juni 2010.

4.2 Alat dan Bahan

4.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator, labu evaporator, Vortex Sibata, syringe driven filter unit Millex GP ukuran 0,20 µm, vial, UV cabinet, chamber, cawan petri, timbangan analitik, lemari asam, pipa kapiler, corong, corong pisah, pipet tetes, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, pipet takar, laminar airflow, autoklaf, shaker, kolom kromatografi, MS Water LCT Premier Xe Micromass Technology, HPLC Shimadzu LC-20 AB, dan pipet mikro.

4.2.2 Bahan Uji

Bahan yang diuji adalah berberin. 18

4.2.3 Bahan Kimia

Bahan –bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah plat KLT silica gel 60 F 254 , sephadex LH –20, kolom Capcell Pak C-18 Shiseido 4,5 mmx260 mm, asetonitril, air millipore, metanol, aquadest, diklorometan, n-heksana, asam asetat glasial, reagen dragendroff, reagen serium, air sumur, medium glucose yeast-extract peptone GYP, medium potato dextro broth PDB, medium potato dextrose agar PDA komposisi medium dapat dilihat pada lampiran 1, dan gas N 2 .

4.3 Prosedur Kerja

4.3.1 Skrining Biotransformasi Berberin

4.3.1.1 Isolat Jamur

Jamur yang digunakan adalah 4 isolat jamur endofit yang diisolasi dari tanaman akar kuning, yaitu AFKR –2, 3, 5, dan 13.

4.3.1.2 Pembuatan Medium Kultivasi

Medium GYP dibuat dengan melarutkan 2,5 gram pepton, 0,5 gram yeast extract, 10 gram glukosa, 0,25 gram KH 2 PO 4 , 0,25 gram MgSO 4 .7H 2 O, 5 mg FeSO 4 .7H 2 O, 0,1 gram CaCO 3 ke dalam 500 ml air sumur. Setelah semua komponen larut, bagi medium tersebut ke dalam erlenmeyer 300 ml masing-masing sebanyak 100 ml sesuai jumlah isolat jamur kemudian tutup dengan aluminium foil. Semua medium 19 disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 C selama 20 menit. Medium PDB dibuat dengan melarutkan 12 gram PDB ke dalam 500 ml air sumur. Setelah semua komponen larut, medium tersebut dibagi ke dalam lima erlenmeyer 300 ml masing –masing sebanyak 100 ml kemudian ditutup dengan aluminium foil. Semua erlenmeyer berisi medium kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 20 menit.

4.3.1.3 Kultivasi Jamur Endofit

Seluruh isolat jamur yang ditumbuhkan pada medium PDA dipotong kecil kurang lebih 0,5x0,5 cm kemudian diambil sebanyak 4 potong lalu jamur tersebut dipindahkan ke dalam medium GYP dan PDB yang telah disterilkan dan didinginkan. Satu erlenmeyer disiapkan sebagai blanko dengan hanya berisi medium GYP dan PDB. Pengerjaan kultivasi jamur endofit dilakukan dalam keadaan steril di dalam laminar airflow. Medium GYP dan PDB yang telah berisi jamur endofit kemudian diinkubasi dengan shaker pada suhu 27 C dengan kecepatan 120 rpm selama 4 hari.

4.3.1.4 Penambahan Substrat Pada Kultur

Penambahan substrat berberin dilakukan setelah kultur berumur 4 hari. Substrat yang ditambahkan pada kultur dibuat dengan menambahkan 10 mg berberin ke dalam 10 ml 20 metanol. Kemudian larutan tersebut disaring dengan menggunakan syringe Millex GP dengan diameter pori 0,20 µm dalam keadaan steril. Larutan berberin yang telah disterilkan tersebut dipipet sebanyak 10 ml dengan konsentrasi berberin 1 mg dalam 1 ml metanol, kemudian masing –masing dimasukkan ke dalam kultur jamur endofit dan blanko. Kemudian kultivasi dilanjutkan dengan menginkubasi menggunakan shaker pada suhu 27 C dengan kecepatan 120 rpm.

4.3.1.5 Monitoring hasil biotransformasi

Biotransformasi dimonitoring untuk memantau apakah telah terjadi biotransformasi berberin dengan cara pengambilan sampel terhadap kultur jamur endofit yang telah ditambahkan substrat berberin. Sampling pertama dilakukan setelah 1 hari penambahan berberin pada kultur jamur endofit. Erlenmeyer yang berisi blanko dan kultur jamur endofit dalam medium GYP dan PDB yang telah ditambahkan substrat berberin dipipet kira –kira 5 ml dan kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu tambahkan dengan diklorometan : metanol = 5:1 sebanyak 5 ml, kemudian dikocok dengan vortex dan didiamkan 10 menit sehingga akan terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah tersebut kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evaporator dan dikeringkan dengan rotary evaporator hingga didapatkan 21 ekstrak kental. Ekstrak kemudian dianalisis dengan KLT fase diam silica gel 60 F 245 dan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml yang ditambahkan asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan reagen dragendroff. Pengambilan sampel dilakukan pada 1 hari, 2 hari, 3 hari, dan 7 hari setelah penambahan berberin.

4.3.1.6 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit

Ekstraksi kultur jamur endofit dalam medium GYP dan PDB dilakukan 14 hari setelah penambahan berberin ke kultur jamur dengan pelarut diklorometan : metanol = 5:1. Ekstraksi dilakukan dengan corong pisah dan diambil lapisan bawah kemudian dikeringkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang telah dikeringkan lalu ditimbang. Setelah itu, ekstrak di analisis menggunakan KLT dengan fase diam silica gel 60 F 254 dan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml dan ditambahkan asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan reagen dragendroff.

4.3.2 Scalling up Proses Biotransformasi

4.3.2.1 Pembuatan Medium Kultivasi

Medium GYP dibuat dengan melarutkan 5 gram pepton, 1 gram yeast extract, 20 gram glukosa, 0,5 gram KH 2 PO4, 0,5 22 gram MgSO 4 .7H 2 O, 10 mg FeSO 4 .7H 2 O, 0,2 gram CaCO 3 ke dalam 1000 ml air sumur. Setelah semua komponen larut, bagi medium tersebut ke dalam erlenmeyer masing –masing sebanyak 200 ml dalam erlenmeyer 500 ml sesuai jumlah isolat jamur kemudian tutup dengan aluminium foil. Kelima erlenmeyer berisi medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 20 menit.

4.3.2.2 Kultivasi jamur endofit AFKR-5

Jamur endofit AFKR-5 yang ditumbuhkan pada medium PDA dipotong kecil kurang lebih 0,5 x 0,5cm dan diambil sebanyak 4 buah kemudian dimasukkan ke dalam medium GYP yang telah disterilkan dan didinginkan. Pengerjaan kultivasi jamur endofit dilakukan dalam keadaan steril di dalam laminar airflow. Medium yang telah berisi jamur endofit diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 27 C dengan kecepatan 120 rpm selama 4 hari.

4.3.2.3 Penambahan substrat pada kultur jamur endofit AFKR-5

Penambahan substrat berberin dilakukan seperti saat skrining. Substrat yang akan ditambahkan pada kultur dibuat dengan menambahkan 100 mg berberin ke dalam 100 ml metanol. Kemudian larutan tersebut disaring dengan menggunakan syringe Millex GP dengan diameter pori 0,20 µm dalam keadaan steril. 23 Larutan berberin steril dengan konsentrasi 1 mgml dipipet sebanyak 20 ml kemudian dimasukkan ke dalam setiap kultur jamur endofit. Kultivasi dilanjutkan dengan menginkubasi medium menggunakan shaker hingga hari ke-14.

4.3.2.4 Monitoring hasil biotransformasi

Biotransformasi dimonitoring untuk memantau apakah telah terjadi biotransformasi berberin dengan cara melakukan pengambilan sampel terhadap kultur jamur endofit pada hari ke-10 setelah penambahan berberin. Kultur jamur endofit dalam medium GYP saat 10 hari setelah penambahan substrat berberin dipipet sebanyak ± 5 ml dan kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu tambahkan dengan diklorometan : metanol = 5:1 sebanyak ± 5 ml, kemudian dikocok menggunakan vortex dan didiamkan beberapa menit sehingga akan terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah tersebut kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evaporator kemudian dikeringkan. Ekstrak kemudian dianalisis dengan KLT fase diam silica gel 60 F 254 dan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml yang ditambahkan asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Selain dengan KLT, hasil penyamplingan ini juga dianalisis menggunakan HPLC dengan kondisi HPLC = Capcell Pak C-18 Shiseido 4,6 mm 24 x 250 mm , fase gerak air millipore : asetonitril = 90 : 10 , laju alir 1 mlmenit, lama aliran 30 menit, detektor UV dengan panjang gelombang 266 nm.

4.3.2.5 Ekstraksi kultur jamur endofit AFKR-5

Kultur jamur endofit setelah 14 hari penambahan berberin dikecilkan ukurannya menggunakan spatula. Kemudian kultur tersebut diekstrak menggunakan diklorometan : metanol = 5:1. Sebanyak ± 50 ml pelarut campur dimasukkan ke dalam kultur jamur, kemudian dikocok menggunakan magnetic stirer selama 10 menit. Setelah itu,jamur dipisahkan dengan filtrat menggunakan saringan. Proses ini diulang sebanyak 3 kali. Hasil saringan filtrat merupakan ekstrak yang kemudian dikeringkan lalu ditimbang kemudian dianalisis dengan KLT fase diam silica gel 60 F 254 dan eluen diklrometan : metanol = 6:1 7 ml yang ditambah 1 tetes asam asetat glasial. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Selain dengan KLT, hasil pengambilan sampel ini juga dianalisis menggunakan HPLC dengan kondisi HPLC = Capcell Pak C-18 Shiseido 4,6 mm x 250 mm , fase gerak air millipore : asetonitril = 90 : 10 , laju alir 1 mlmenit, lama aliran 30 menit, detektor UV dengan panjang gelombang 266 nm. 25

4.3.2.6 Partisi ekstrak hasil biotransformasi

Ekstrak kental hasil ekstraksi dilarutkan dengan metanol kemudian dipartisi menggunakan n-heksan. Partisi ini dilakukan dengan corong pisah sehingga kemudian didapatkan dua lapisan lapisan atas air, lapisan bawah diklorometan dan diambil lapisan bawah. Lapisan bawah tersebut kemudian dikeringkan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak kental yang didapat kemudian dianalisis dengan KLT fase diam silica gel 60 F 254 dan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml yang ditambahkan asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan reagen serium.

4.3.2.7 Fraksinasi hasil biotransformasi AFKR-5

Ekstrak hasil partisi difraksinasi dengan menggunakan kolom kromatografi dengan fase diam sephadex LH –20 volume 275 ml dan fase gerak metanol 90. Hasil fraksinasi ditampung dengan tabung reaksi dan setiap tabung dicek dengan analisis KLT fase diam silica gel 60 F 254 dan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml ditambah asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan pereaksi dragendroff. Isi tabung –tabung yang memiliki noda yang sama pada 26 kromatogram KLT digabungkan menjadi satu fraksi. Tabung 3-6 digabung menjadi fraksi satu. Tabung 7-8 digabung menjadi fraksi dua dan tabung 9-11 digabungkan menjadi fraksi tiga.

4.3.2.8 Purifikasi produk biotransformasi AFKR - 5 fraksi 1

Ketiga fraksi yang diperoleh dari fraksinasi menggunakan kromatografi kolom kemudian dianalisis dengan KLT fase diam silica gel 60 F 254 dan fase gerak diklorometan : metanol = 6 : 1 7 ml dan ditambah asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati di bawah sinar pada panjang gelombang UV 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dragendroff. Fraksi satu kemudian dipurifikasi menggunakan KLT preparatif dengan fase diam silica gel 60 F 254 dan fase gerak diklorometan : metanol : amoniak 25 = 5:3:0,5 . Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Setelah itu noda tersebut dikerok kemudian dilarutkan dengan diklorometan dan metanol, kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring. Hasil saringan yang didapatkan dikeringkan dan kemudian dianalisis dengan KLT menggunakan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml dengan ditambahkan asam asetat glasial 1 tetes. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm dan setelah itu hitung Rfnya. 27

4.3.2.9 Karakterisasi produk hasil biotransformasi dengan MS

Senyawa hasil biotransformasi berberin dianalisis menggunakan MS Water LCT Premier Xe Micromass Technology. 28

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Skrining Biotransformasi Berberin

Dengan dilakukannya skrining biotransformasi berberin ini, dapat dilihat kemampuan dari 4 isolat jamur endofit dalam melakukan proses biotransformasi dalam medium GYP dan PDB. Monitoring terhadap proses biotransformasi oleh jamur endofit tersebut dilakukan dengan cara melakukan penyamplingan setelah 1 hari, 2 hari, 3 hari dan 7 hari penambahan berberin ke dalam kultur jamur endofit. Proses transformasi diamati dengan melakukan analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT terhadap ekstrak kultur jamur. KLT tersebut kemudian dielusi dengan menggunakan fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 dan ditambahkan 1 tetes asam asetat glasial. Namun hingga penyamplingan hari ke-7, kromatogram hasil KLT belum menampakkan terjadinya reaksi biotransformasi. Reaksi biotransformasi baru terlihat pada ekstrak kultur jamur pada 14 hari penambahan berberin gambar 6. Hasil skrining memperlihatkan bahwa reaksi biotransformasi terjadi pada kultur jamur endofit AFKR-5 dan AFKR-13 pada medium GYP. Sedangkan pada jamur endofit yang dikultivasi pada medium PDB tidak memperlihatkan berjalannya reaksi biotransformasi. Berikut adalah profil kromatogram KLT dari skrining biotransformasi berberin : 29 a b c d Gambar 6. Profil kromatogram KLT fase diam silica gel 60 F 254 , fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml ditambah 1 tetes asam asetat glasial ekstrak diklorometan-metanol dari kultur jamur endofit AFKR-2, 3, 5, dan 13 pada medium GYP dan PDB saat 14 hari penambahan berberin. fase diam silica gel 60 F 254, fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 ditambahkan 1 tetes asam asetat.S=berberin; C=blanko medium; 2,3,5,13=AFKR-2,3,5,13. a sinar UV 254 nm, bsinar UV 366 nm pada medium GYP,c sinar UV 245 nm, d sinar UV 366 nm pada medium PDB Dari hasil skrining yang dilakukan terhadap 4 isolat jamur endofit dari akar kuning terlihat bahwa AFKR –5 dan AFKR-13 pada medium GYP dapat melakukan reaksi biotransformasi terhadap berberin. Hasil skrining ini juga memperlihatkan berbedanya kemampuan setiap jamur endofit dalam mentransformasikan senyawa berberin bergantung pada medium kultur. Hal tersebut terlihat pada hasil noda dari hasil skrining dimana jamur endofit produk berberin 30 AFKR –5 dan AFKR–13 mampu melakukan biotransformasi pada medium GYP sedangkan jamur –jamur endofit tersebut tidak memperlihatkan kemampuan biotransformasi pada medium PDB. Medium kultur yang berbeda akan memberikan hasil biotransformasi yang berbeda dimana medium memberikan pengaruh nutrisi yang diterima oleh jamur endofit, sehingga medium kultur jamur yang berbeda akan memperoleh nutrisi yang berbeda pula. Hasil skrining yang dilakukan memperlihatkan bahwa jamur endofit AFKR –5 dan AFKR–13 pada medium GYP dapat melakukan biotransformasi berberin. Oleh karena itu dilakukanlah scalling up reaksi biotransformasi berberin dengan salah satu isolat jamur endofit yang dapat melakukan reaksi biotransformasi yaitu AFKR-5 pada medium GYP. Dari hasil KLT saat skrining biotransformasi gambar 6 AFKR-5 memperlihatkan noda produk hasil biotransformasi yang lebih besar dibandingkan dengan AFKR –13. Untuk membuktikan bahwa senyawa produk biotransformasi tidak dihasilkan oleh jamur endofit AFKR –5 sebagai metabolit sekunder jamur tersebut dilakukan dengan bantuan analisis KLT. Hal tersebut dilakukan dengan membandingkan KLT dari kultur jamur AFKR –5 yang ditambahkan berberin dengan kontrolnya yaitu yang tidak ditambahkan berberin Gambar 7. Hasil KLT tersebut memperlihatkan bahwa jamur endofit AFKR –5 pada medium GYP tidak menghasilkan produk hasil biotransformasi. Noda yang muncul pada ekstrak jamur endofit AFKR –5 dengan penambahan berberin tidak terdapat pada ekstrak jamur endofit AFKR –5 tanpa penambahan berberin. Senyawa hasil biotransformasi ini berada di atas berberin yang 31 memperlihatkan bahwa senyawa hasil biotransformasinya bersifat relatif lebih nonpolar dibandingkan berberin. a b Gambar 7. Profil ktomatogram KLT fase diam silica gel 60 F 254 , fase gerak diklorometan : metanol = 6:1 7 ml ditambah 1 tets asam asetat glasial ekstrak diklorometan – metanol kultur jamur endofit AFKR-5 pada medium GYP. S = berberin, 1 = AFKR –5 ditambahkan berberin, 2 = AFKR-5 tanpa penambahan berberin, a UV 254 nm, b UV 366 nm.

5.2 Profil Jamur AFKR– 5