Biotransformasi palmation oleh Jamur endofit dari tumbuhan akar kuning : Menispermaceae

i

BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR ENDOFIT

DARI TUMBUHAN AKAR KUNING

(

Arcangelisia flava

L.Merr : MENISPERMACEAE)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

Oleh :

Wida Kharismaya

NIM : 106102003376

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN & ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2010

ii NAMA : WIDA KHARISMAYA NIM : 106102003376

JUDUL : BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR

ENDOFIT DARI TUMBUHAN AKAR KUNING

(Arcangelisia flava L. Merr : MENISPERMACEAE)

Disetujui oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Andria Agusta____

NIP. 196908161994031003 NIP. 197308222008012007 Zilhadia M.Si, Apt

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

NIP. 330003139

iii

Skripsi dengan judul

BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava L. Merr :

MENISPERMACEAE)

Telah disetujui, diperiksa dan dipertahakan dihadapan tim penguji oleh Wida Kharismaya

NIM: 106102003376 Menyetujui, Pembimbing:

1. Pembimbing I Dr. Andria Agusta ... 2. Pembimbing II Zilhadia, M.Si, Apt. ...

Penguji:

1. Ketua Penguji Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ... 2. Anggota Penguji I Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ... 3. Anggota Penguji II Ofa Suzanti Betha, M.Si.Apt ... 4. Anggota Peguji III Azrifitria, M.Si, Apt. ...

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Prof. DR. (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And Tanggal lulus : 27 Juli 2010

iv

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul :

BIOTRANSFORMASI PALMATIN OLEH JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava L. Merr :

MENISPERMACEAE)

Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Ilmu adalah sebaik-baiknya perbendaharaan dan yang paling

indahnya adalah ia ringan dibawa, namun besar manfaatnya.

Ditengah-tengah orang banyak ia indah, sedangkan dalam

kesendirian ia menghibur.”

Skripsi ini saya persembahkan kepada :

Ayahanda dan Ibunda tercinta yang dengan kasih sayang serta doa yang tak pernah putus selalu mengiringi langkah ananda dalam menuntut ilmu. Mungkin selama ini ananda belum dapat memberikan yang terbaik untuk ayah

dan ibu, tapi semoga karya kecil ini dapat membuat ayah dan ibu sedikit bangga kepada ananda . Doakan ananda semoga ananda dapat melanjutkan perjalanan ini dan semoga ilmu yang telah ada dapat selalu ananda amalkan

dan bermanfaat bagi orang banyak. Amiin…

Keluarga besar Farmasi UIN Jakarta yang selama kurang lebih empat tahun mewarnai perjalanan saya dalam menuntut ilmu pengetahuan. Terimakasih kepada dosen-dosen farmasi yang telah dengan sabar memberikan didikan dan

bimbingan kepada saya. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat khususnya bagi saya pribadi dan bagi rekan-rekan farmasi sekalian.

Keluarga besar Puslit LIPI Cibinong khususnya untuk Dr. Andria Agusta dkk (keluarga besar Lab Fitokimia ) yang telah memberikan kesempatan dan bimbingan kepada saya dalam melakukan penelitian. Sungguh pengalaman yang sangat luar biasa bagi saya , karena banyak ilmu dan pelajaran berharga

yang saya dapatkan selama penelitian di sana.

“Ya Allah , sesungguhnya aku menitipkan kepada-Mu apa yang

telah Engkau ajarkan kepadaku , maka kembalikanlah kepadaku

pada saat aku membutuhkannya dan janganlah Engkau jadikan aku

vi

Puji syukur Kehadirat Allah SWT Yang Maha Kuasa , karena berkat rahmat dan kuasa-Nya serta kasih sayang-Nya yang tak pernah putus, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Biotransformasi Palmatin oleh Jamur Endofit dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Merr : Menispermaceae)”.

Penyusunan skipsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Karena itu pada kesempatan kali ini dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada yang terhormat:

1. Bapak Dr. Andria Agusta dan Ibu Zilhadia, M.Si, Apt. sebagai pembimbing dalam skripsi ini yang telah meluangkan banyak waktu dengan sabar dalam memberikan pengarahan, bimbingan, motivasi, nasehat, serta petunjuk dari awal penelitian hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

2. Bapak Prof. Dr (hc). Dr, M. K Tadjudin, Sp. And, selaku dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melakukan penelitian.

3. Bapak Drs. M. Yanis Musdja M. Sc, Apt sebagai ketua jurusan Farmasi yang telah memberikan kesempatan dan dukungannya kepada penulis dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini.

4. Ayahanda Drs. Sutiono dan Ibunda Eti Hernawati S.Pd yang selalu memberikan kasih sayang dan dukungan baik moral maupun materil sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. Juga kepada semua keluarga tercinta yang tidak henti-hentinya memberikan dukungan dan doanya. 5. Dosen-dosen Farmasi UIN yang selama ini telah sabar mendidik dan

membantu serta staf akademik farmasi yang telah membantu penulis sejak awal masuk perkuliahan hingga akhirnya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini .

6. Ibu Yuliasri Jamal, Ibu Hertina, Ibu Praptiwi, Mas Toni dan Kang Asep dari Laboratorium Fitokimia bidang Botani, Puslit Biologi LIPI, yang telah memberikan bantuan selama penelitian.

vii

7. Teman-teman program studi Farmasi , Suvrela, Eka W, Syifa, Amalia serta teman lainnya khususnya angkatan 2006 yang selama kurang lebih empat tahun telah melewati hari demi hari dengan kebersamaan yang indah dan selalu memberikan dukungan dan doanya kepada penulis. Juga kepada kakak-kakak kelas yang telah memberikan motivasi dan doanya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

8. Teman-teman biosains community 2010 Yaya, Naomi, Dini Fris, Dini Mai, Reza, Rijal dan Emil yang telah memberikan doa dan dukungan serta bantuannya kepada penulis selama penelitian berlangsung hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

9. Teman-teman PML , mas dede , mba lia dan semuanya yang telah memberikan bantuan serta doanya untuk penulis hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

10.Abdul Wahab, S.E dan keluarga yang selalu memberikan semangat dan doanya dari sejak penelitian, sidang hasil hingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik.

11.Semua pihak yang telah membantu dari awal hinga akhir penyusunan skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.Terimakasih untuk doa dan dukungannya.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, seperti tak ada gading yang tak retak seperti itulah penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar skripsi penelitian ini benar-benar bermanfaat untuk kita semua. “Amin”

Jakarta, Juli 2010 Penulis

viii

TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava L. Merr: MENISPERMACEAE)

Salah satu jamur endofit yang diperoleh dari tumbuhan akar kuning (Arcaangelesia flava L. Merr.) yaitu, AFKR-3 telah diketahui mampu melakukan biotransformasi berberin. Dalam penelitian ini, dilakukan serangkaian penelitian untuk mengetahui kemampuan jamur AFKR-3 tersebut dalam mentransformasi senyawa alkaloid lainnya yaitu palmatin. Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 dilakukan di dalam medium PDB (Potato Dextro Broth). Penambahan substrat dilakukan secara bertahap, pertama dengan penambahan larutan palmatin sebanyak 2 ml (1 mg/ml methanol) setelah kultur berumur 1 hari. Kemudian penambahan yang kedua dilakukan setelah kultur jamur berumur 4 hari dengan jumlah larutan substrat sebanyak 20 ml. Setelah kultur diinkubasi selama 2 minggu seluruh medium dan biomassa diekstraksi dengan pelarut diklorometan : methanol (5:1). Ekstrak pekat dikrometan-metanol dilarutkan dengan methanol kemudian dipartisi dengan n-hexan untuk menghilangkan asam-asam lemak dan senyawa non polar lainnya yang terbentuk. Selanjutnya ekstrak pekat metanol di fraksinasi dengan kromatografi kolom dengan fase diam sephadex LH-20 (275 ml) dan fase gerak methanol 90%. Dari fraksinasi diperoleh 2 fraksi (fraksi 1 dan fraksi 2) yang menunjukan adanya senyawa palmatin dan produk biotransformasinya. Fraksi 1 di purifikasi dengan KLT preparatif untuk memperoleh isolat murni. Dari hasil isolasi diperoleh 3 produk biotransformasi dengan nilai Rf masing-masing (P1, 1.6 mg) 0.54, (P2, 1.6 mg) 0.52, (P3, 2.1 mg) 0.5. Hasil spektroskopi massa P3 menunjukan bahwa terjadi penambahan bobot molekul sebanyak 16 amu. Dan diduga pada P3 tersebut terjadi penambahan atom O (oksigen).

ix

BIOTRANSFORMATION OF PALMATINE BY ENDOPHYTIC FUNGI FROM AKAR KUNING PLANT (Arcangelisia flava L. Merr :

MENISPERMACEAE)

One of the endophytic fungi which is obtained from Akar kuning plant (Arcangelisia flava L.Merr) namely AFKR-3 has been recognized that it is able to perform berberine transformation. In this experiment , we have done some research to know the ability of this AFKR-3 fungi to transform another alkaloid, namely , palmatin. Biotransformation of palmatin by fungus AFKR-3 is done in medium of PDB (Potato Dextro Broth). The addition of substrate which is done regulary, first after one day cultivation, add palmatine solution as much as 2 mg (1 mg/ml methanol). The second addition continue after 4 day cultivation, as much as 20 ml substrate addition. After two weeks cultivation , all of medium and biomass was extracted by using mixture of dichloromethane : methanol (5 : 1). Dry extract of dichloromethane : methanol was dissolved with methanol and then partitioned with n-hexan for removing fatty acids and non polar substances formed. Furthermore, dry extract of methanol was fractionated by column chromatography by using adsorben sephadex LH-20 (275 ml) and eluent methanol 90%. From the fraction is obtained 2 fraction (fraction 1 and fraction 2) shown that there is palmatine and biotransformation product. Fraction 1 is purified by TLC preparative to obtain pure isolates. From the results of isolation, there are three biotransformation product with Rf value of each are (P1, 1.6 mg), 0:54, (P2, 1.6 mg), 0:52, (P3, 2.1 mg) 0.5. The result of analysis P3 by Mass Spectroscopy show that there are addition of molecular weight as much as 16 amu. . Its predicted there is an addition oxygen atomic in biotransformation product (P3). Keywords : palmatine, endophytic fungi, akar kuning.

x

Halaman Judul ………. Lembar Persetujuan Proposal Skirpsi... Lembar Pengesahan... Lembar Pernyataan……….. Lembar Persembahan………... Kata Pengantar………. Abstrak………. Abstract……….... Daftar Isi……….. Daftar Tabel………. Daftar Gambar………. Daftar Lampiran………... BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ... 1.2 Perumusan Masalah... 1.3 Tujuan Penelitian... 1.4 Hipotesis... 1.5 Manfaat Penelitian... 1.6 Batasan Penelitian... BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tumbuhan Akar Kuning

2.1.1 Klasifikasi... 2.1.2 Nama Daerah... 2.1.3 Sinonim... 2.1.4 Deskripsi... 2.1.5 Kegunaan... 2.1.6 Kandungan Kimia... 2.2 Mikroba endofit

2.2.1 Definisi dan Perkembangan Mikroba endofit... 2.2.2 Isolasi Jamur Endofit... 2.2.3 Metabolit-Metabolit dari Mikroba Endofit... 2.3 Biotransformasi... 2.4 Palmatin... BAB III KERANGKA KONSEP ...

i ii iii iv v vi viii ix x xii xiii xiv 1 4 4 5 5 5 6 7 7 7 8 8 9 10 12 14 18 19

xi

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian... 4.2 Alat dan Bahan... 4.3 Metode Penelitian... 4.4 Prosedur Kerja

4.4.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Mer) ... 4.4.2 Biotransformasi Palamatin oleh Jamur AFKR-3.... 4.4.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur

AFKR-3... 4.4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin oleh

Jamur AFKR-3 pada Medium PDB... 4.4.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin oleh

Jamur AFKR-3 (Ekstrak

diklorometan-metanol)... 4.4.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi

Palmatin oleh Jamur AFKR-3... 4.4.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)... 4.4.8 Karakterisasi Produk Biotransformasi... BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari

Arcangelisia flava L. Mer... 5.2 Biotransformasi Palamatin oleh jamur AFKR-3... 5.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3 5.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin... 5.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin... 5.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi... 5.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)... 5.8 Karakterisasi Produk Biotransformasi... BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan ... 6.2 Saran ... DAFTAR PUSTAKA ... LAMPIRAN ... 20 20 21 21 22 24 27 28 28 29 29 30 32 35 37 39 40 42 44 46 46 47 50

xii

Halaman 1. Tabel 1. Nilai Rf fraksi 1 setelah di KLT preparatif

dengan etilasetat: isopropanol : amoniak 25% (8:8:1)... 2. Tabel 2. Produk biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3

pada medium PDB (Potato Dextro Broth ) setelah diisolasi dan dipurifikasi... 3. Tabel 3. Komposisi Medium Potato Dextro Broth (PDB)………... 4. Tabel 4. Komposisi Medium Agar……….... 5. Tabel 5. Komposisi Medium Potato Dextro Agar (PDA)………

43 44 50 50 50

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Gambar 1. Batang dan daun Akar Kuning………....

2. Gambar 2. Reaksi Biotransformasi Kuinin oleh jamur Xylaria sp………… 3. Gambar 3. Struktur Molekul Palmatin ………...……….. 4. Gambar 4. Profil Kromatogram KLT Palmatin……….... 5. Gambar 5. Profil Kromatogram HPLC Palmatin ………. 6. Gambar 6. Hasil Spektroskopi Massa Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr.. 7. Gambar 7. Jamur AFKR-3 pada medium PDA setelah berumur 4 hari…... 8. Gambar 8. Profil kromatogram KLT ekstrak dikrorometan:metanol (5 :1) 9. Gambar 9. Kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB ... 10.Gambar 10. Profil Kromatogram HPLC ekstrak diklorometan:metanol

(5:1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB

setelah 1 dan 2 minggu... 11.Gambar 11. Profil Kromatogram KLT ekstrak diklorometan : metanol

(5:1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB

setelah 2 minggu... 12.Gambar 12. Hasil isolat ekstrak metanol dengan kromatografi

kolom sistem isokratik………... 13.Gambar 13. Profil kromatogram KLT ekstrak metanol fraksi 1 dan 2... 14.Gambar 14. Profil kromatogram KLT preparatif ekstrak metanol fraksi 1... 15.Gambar 15. Hasil analisis spektroskopi massa

(LCMS LCT Premier XE) produk 3... . 6 15 18 31 31 32 33 34 36 37 38 40 41 42 45

xiv

Halaman 1. Lampiran 1. Tabel Komposisi Medium

1.1Medium PDB (Potato Dextro Broth)……….

1.2Medium Agar ………

1.3Medium PDA (Potato Dextro Agar)………. 2. Lampiran 2. Skema Kerja

2.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr

2.1.1 Analisis KLT………. 2.1.2 Analisis HPLC………... 2.1.3 Analisis MS……… 2.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3……… 2.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh

Jamur AFKR-3……… 2.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi…...………... 2.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi.……… 2.6 Fraksinasi, Purifikasi dan Karakterisasi

Hasil Biotransformasi……….. 50 50 50

51 51 51 52 53 54 55 55

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Mikroba endofit belakang ini memiliki peranan yang cukup penting dalam bidang bioteknologi, karena kemampuannya dalam menghasilkan metabolit sekunder yang dapat digunakan sebagai bahan baku obat. Telah banyak riset yang menunjukan peranan bioteknologi dalam budidaya, multiplikasi, rekayasa genetika, dan skrining mikroba endofit yang dapat menghasilkan metabolit sekunder yang sangat penting dalam rangka pengembangan bahan obat yang berasal dari tanaman obat ini. (Radji, 2005). Salah satu contoh produksi metabolit sekunder yang telah dilaporkan adalah

produksi dua metabolit bisanthraquinone yaitu episitoskirin dan bislunatin

dalam medium cair Potato Dextrose Broth (PDB) yang dihasilkan oleh

jamur endofit Diaporthe sp. (Agusta. et al, 2006). Dan masih banyak

metabolit lain yang memiliki aktivitas farmakologi yang cukup baik yang dapat dihasilkan oleh mikroba endofit.

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari

bakteri dan jamur (Strobel. et.al. 2003). Sehingga apabila endofit yang

diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid atau

metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan besar memerlukan puluhan tahun untuk dapat dipanen.

Disamping dapat menghasilkan suatu metabolit sekunder, mikroba endofit juga mampu mentransformasi senyawa metabolit sekunder menjadi senyawa baru yang memiliki kerangka dasar yang mirip atau derivat dari metabolit yang ditransformasi. Proses tersebut dinamakan proses biotransformasi, dimana suatu mikroba endofit dengan kemampuan enzimatiknya dapat mengubah suatu metabolit sekunder menjadi produk baru. Proses ini dapat dilakukan dengan penambahan suatu substrat ke dalam kultur jamur, dimana substrat yang digunakan adalah senyawa aktif atau senyawa metabolit sekunder yang ingin dibiotransformasi. Jamur tersebut dapat mengubah substrat menjadi senyawa baru atau dapat mengubah suatu senyawa tidak bermanfaat menjadi senyawa yang bermanfaat. Beberapa penelitian mengenai biotransformasi telah dilakukan

diantaranya biotransformasi 5 buah senyawa flavan oleh jamur Diaporthe sp

yang diisolasi dari tumbuhan teh / Camelia sinensis (Agusta. et al, 2005),

Biotransformasi kuinin oleh jamur endofit Xylaria sp yang diisolasi dari

tumbuhan kina (Shibuya. et al, 2003). Hal tersebut merupakan bukti bahwa

jamur endofit dapat mengubah komponen kimia dari tumbuhan inangnya.

Proses biotransformasi mulai dikembangkan untuk menghasilkan suatu metabolit baru yang diharapkan memiliki kemampuan lebih dibandingkan metabolit asalnya. Pada umumnya metabolit sekunder yang

dihasilkan dari suatu tanaman, selain memiliki efek farmakologi yang baik, juga memiliki berbagai kelemahan diantaranya dari segi farmasetik yang kurang baik seperti kestabilan, sifat fisikokimia yang buruk. Terkadang zat aktif yang di duga memiliki efek terapi yang baik biasanya juga memiliki efek toksik yang cukup tinggi. Dari alasan-alasan tersebut maka suatu metabolit sekunder yang telah ada dapat dimodifikasi menjadi suatu metabolit lain yang diharapkan memiliki sifat atau keunggulan dibandingkan dengan metabolit awalnya.

Tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr) merupakan

salah satu jenis tanaman yang memiliki aktivitas farmakologi yang sudah sejak lama digunakan untuk obat secara tradisional. Salah satu penggunaannya adalah untuk obat diare dan malaria . Di Indonesia tumbuhan ini banyak terdapat di Kalimantan, Sumatera dan Jawa. Metabolit sekunder yang dimiliki oleh tumbuhan ini , salah satunya adalah senyawa alkaloid. Pada penelitian terdahulu, telah diisolasi alkaloid dari Arcangelisia flava L. Merr yang meliputi enam senyawa alkaloid kuartener yaitu thalifedine, dehydrocorydalime, pcynarrhine, berberin, palmatin, dan jatrorrhizine serta tiga senyawa alkaloid tersier (Verpoote , 1982).

Dari penelitian sebelumnya telah dilakukan isolasi jamur endofit dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr). Dan diperoleh beberapa isolat jamur endofit, dan salah satunya adalah jamur endofit AFKR-3. Jamur tersebut diketahui dapat melakukan biotransformasi terhadap senyawa berberin. (Mahesa, 2009). Untuk mengetahui apakah jamur endofit AFKR-3 memiliki kemampuan biotransformasi terhadap

senyawa lain maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Dalam penelitian ini , dilakukan pengujian biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 dan dilihat apakah jamur tersebut mampu mengubah senyawa palmatin menjadi senyawa baru turunannya.

1.2. Perumusan Masalah

Apakah jamur endofit AFKR-3 yang diisolasi dari tumbuhan

Arcangelisia flava L. Merr dapat melakukan biotransformasi terhadap senyawa palmatin, sehingga dapat mengubah stuktur kimia senyawa tersebut menjadi senyawa lain turunannya? Kondisi apa yang cocok untuk melakukan proses biotransformasi ini serta bagaimanakah struktur kimia produk yang dihasilkan?

1.3. Tujuan Penelitian

1. Melakukan biotransformasi senyawa palmatin oleh jamur endofit AFKR-3 yang diisolasi dari tumbuhan Arcangelisia flava.L. Merr 2. Mengetahui kondisi yang cocok bagi jamur AFKR-3 tersebut untuk

melakukan proses biotransformasi terhadap senyawa palmatin.

3. Mengetahui struktur kimia produk yang dihasilkan dari biotransformasi palmatin oleh jamur endofit dari tumbuhan akar kuning ( Arcangelisia flava.L. Merr ) .

1.4. Hipotesis

Isolat jamur endofit dari Arcangelisia flava L. Merr (AFKR-3) dapat mengubah atau melakukan transformasi terhadap senyawa palmatin menjadi produk turunannya dalam suatu medium yang cocok .

1.5. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa :

1. Pengetahuan tentang tahapan biotransformasi senyawa palmatin oleh jamur

endofit AFKR-3 yang diisolasi dari Arcangelisia flava L. Merr

2. Informasi mengenai kondisi yang cocok agar reaksi biotransformasi palmatin oleh jamur endofit tersebut dapat berjalan.

3. Informasi mengenai produk – produk hasil biotransformasi yang dihasilkan

oleh jamur endofit dari Arcangelisia flava L. Merr tersebut.

1.6. Batasan Penelitian

Dalam penelitian ini dilakukan tahapan biotransformasi senyawa palmatin yang telah diisolasi dari tumbuhan akar kuning oleh isolat jamur endofit dari Arcangelisia flava L. Merr (AFKR-3) hingga diperoleh produk biotransformasinya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Merr)

Gambar 1.Batang dan Daun Akar Kuning

(Sumber:

2.1.1. Klasifikasi

Klasifikasi tumbuhan akar kuning adalah sebagai berikut: Sub Kingdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub kelas : Magnoliidae Ordo : Ranunculales

Famili

Genus

Spesies : Arcangelisia flava L. Merr

2.1.2. Nama daerah

Sunda : Aruey ki koneng Jawa : Oyod sirawanan, Peron Minahasa : Uwas

Halmahera : Gumi modoku Malaysia : Mebgkunyit Philipina : Abutra, Suma

Thailand : Khamin kruea, Kamphaeng jedchunum (Mandia, et al. 1999)

2.1.3. Sinonim

Arcangelisia lemniscata (Miers) Becc, Arcangelisia loureiri (Pierre) Diels

2.1.4. Deskripsi

Tumbuhan ini berupa liana, panjangnya dapat mencapai ± 10 m, batang utama sebelum bercabang dua besarnya seperti lengan/betis orang dewasa, batang tersebut mengandung air, batang dan cabangnya liat, dalam batang berwarna kuning dan rasanya pahit. Bentuk daun bundar telur sampai lonjong/elip yang meruncing di bagian ujung, permukaan daun hijau mengkilat. Perbungaan terdapat pada batang tua atau di ketiak daun, warna bunga kuning pucat. Pada batang atau cabang-cabang yang besar terdapat tandan buah yang menggantung, buah berwarna kuning, terdiri atas daging buah yang berlendir dan biji besar, pipih. (Mandia, et al. 1999).

2.1.5. Kegunaan

Di Indonesia, akar kuning banyak digunakan untuk obat penurun demam dan obat sariawan. Di Thailand, batang akar kuning digunakan sebagai obat saluran cerna dan bunganya digunakan sebagai obat disentri. Di Malaysia, dekok dari batang akar kuning digunakan sebagai obat penurun panas, obat cacing serta obat saluran cerna. Di Philipina, penggunaan akar kuning sebagai antiseptik telah banyak digunakan, selain itu dekok dari batang akar kuning juga digunakan untuk ekspektoran, tonik, obat iritasi lambung serta penyakit saluran cerna lainnya. (Mandia, et al, 1999). Setelah dilakukan beberapa pengujian, terbukti bahwa ekstrak Arcangelisia flava L. Merr ini memiliki kemampuan sebagai antimikroba yang cukup baik. Selain itu ekstrak tersebut juga mampu memberikan aktivitas antioksidan yang cukup baik serta memiliki aktivitas antisitotoksik yang baik pula. (Keawprabud, 2005).

2.1.6. Kandungan kimia

Arcangelisia flava L. Merr yang merupakan famili dari Menispermaceae ini diketahui mengandung campuran alkaloid benzylisoquinoline, yang secara biosintesis diperoleh dari asam amino phenilalanin atau tirosin (Mandia, et al. 1999). Pada batang tanaman

Arcangelisia flava L. Merr mengandung enam macam senyawa alkaloid kuartener yaitu thalifedine, dehydrocorydalim, jatrorrhizine, berberin, pcynarrhin, dan palmatin. Selain itu juga mengandung tiga

macam senyawa alkaloid tersier yaitu hidroksi-berberin, limasin, dan homoarmulin. (Verpoote et al. 1982). Dan terdapat pula tujuh senyawa furanoditerpen juga telah diisolasi dari batang kayu kuning yang meliputi 6-hydroxyarcangelisin, 2-dehidroarcangelisinol, tinophylol, 6-hydroxyfibleucin, 6-hydroxyfibraurin, dan fibleucin. (Kunii. , et al .1995)

2.2Mikroba Endofit

2.2.1 Definisi dan Perkembangan Mikroba Endofit

Endofit berasal dari bahasa Yunani, ‘endo’berarti di dalam dan ‘fit’ (phyte) berarti tumbuhan. Petrini (1991) mendefinisikan endofit sebagai koloni organisme hidup tanpa menimbulkan symptom pada jaringan internal inangnya, walaupun pada periode tertentu akan berakibat timbulnya penyakit. Definisi tersebut lebih memperlihatkan bahwa endofit hanyalah sebagai salah satu tahapan dalam proses infeksi makhluk hidup terhadap inang tanpa pembatasan tipe interaksi yang mungkin terjadi pada endofit dan inangnya.

Pada tahun 1992, Hirsch dan Braun mengemukakan pendapatnya mengenai definisi jamur endofit, yaitu koloni jamur pada jaringan hidup tumbuhan tanpa menimbulkan efek negatif dalam waktu dekat. Definisi tersebut ternyata tidak cukup untuk menunjukan seluruh organisme hidup selain jamur yang juga berperan sebagai endofit. Namun, untuk konteks jamur endofit, definisi yang diberikan oleh Hirsch dan Braun sudah cukup mewakili. Jamur endofit sejati (true endophytic fungi) kemungkinan besar

tidak akan menimbulkan efek negatif terhadap inangnya, sebaliknya malah akan memberikan manfaat. (Agusta .2009)

Menurut Tan RX dan WX. Zou , mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat

koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman

inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan, et.al. 2001).

2.2.2 Isolasi jamur Endofit

Pada umumnya jamur endofit diisolasi dari organ tumbuhan yang masih segar dan telah disterilkan permukaannya. Untuk sterilisasi permukaan organ tumbuhan yang umum digunakan adalah dengan cara merendamnya dalam alkohol (70%-95%). Namun, kemampuan alkohol untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan tersebut memiliki spektrum yang sempit dan sangat terbatas, sehingga perlu dikombinasikan dengan bahan kimia lainnya. Bahan kimia yang sering dikombinasikan

biasanya adalah natrium hipoklorit (NaOCl). (Zang ,et al. 2006 ; Agusta.

2009).

Medium tumbuh untuk proses isolasi jamur akan berpengaruh

terhadap jumlah dan jenis jamur yang akan diisolasi. Agusta et al (2006),

medium corn meal malt agar (CMMA) dengan antibiotik kloramfenikol dan telah dilaporkan terdapat 6 jenis jamur endofit yang diperoleh. Sedangkan pada proses isolasi dengan menggunakan medium agar dan tanpa penambahan antibiotik diperoleh 2 jenis jamur yang berbeda. Pada medium agar, khamir atau yeast juga memperlihatkan pertumbuhan yang sangat lambat sehingga dapat digunakan untuk purifikasi isolat jamur yang tercampur dengan khamir. (Agusta , 2009).

Berikut ini merupakan contoh tahapan isolasi jamur endofit yang

dilakukan oleh Agusta et al,( 2006) dari ranting muda tanaman teh :

1. Organ tumbuhan tertentu (ranting) dicuci bersih dengan air dan

kemudian dipotong-potong dengan ukuran panjang tertentu.

2. Dilakukan sterilisasi terhadap ranting yang telah dipotong dengan

merendamnya dalam etanol 75% selama 1 menit, dalam larutan natrium hipoklorit selama 0.5 menit dan direndam kembali dengan etanol 75% selama 0.5 menit.

3. Ranting yang telah disterilisasikan selanjutnya dibelah dengan

menggunakan pemotong steril.

4. Potongan ranting kemudian diletakan diatas medium CMMA yang

mengandung kloramfenikol (0.5 mg/ ml)

5. Koloni-koloni yang telah tumbuh selanjutnya dipisahkan dengan

2.2.3 Metabolit – Metabolit yang Dihasilkan Jamur Endofit.

Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam media perbenihan yang sesuai. Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya. Beberapa diantaranya adalah :

1. Mikroba endofit yang menghasilkan antibiotika

Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh mikroba

endofit Cryptosporiopsisquercina yang berhasil diisolasi dari tanaman

obat Tripterigeum wilfordii, dan berhasiat sebagai antijamur yang

patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp.

(Strobel et.al. 1999).

Jenis endofit lainnya yang juga menghasilkan metabolit yang memiliki aktivitas antibiotika berspektrum luas adalah jamur endofit

yang diisolasi dari rhizome Acorus calamus , yaitu jamur Fusarium

oxysporum . Selain memiliki kemampuan sebagai antibakteri metabolit yang dihasilkan juga memiliki kemampuan sebagai anti jamur. (Barik,

et al. 2010)

2. Mikroba endofit yang menghasilkan metabolit sebagai antikanker

Paclitaxel dan derivatnya merupakan zat yang berkhasiat sebagai antikanker yang pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh mikroba endofit. Paclitaxel merupakan senyawa diterpenoid yang didapatkan dalam tanaman Taxus. Senyawa yang dapat mempengaruhi molekul tubuli dalam proses pembelahan sel-sel kanker ini, umumnya

diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang diisolasi dari

tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia, dan T. wallichiana. Saat ini

beberapa jenis endofit lainnya telah dapat diisolasi dari berbagai jenis Taxus dan didapatkan berbagai senyawa yang berhasiat sebagai anti tumor. Demikian pula upaya untuk sintesisnya telah berhasil dilakukan (Strobel. et.al. 2002).

3. Mikroba endofit penghasil zat anti malaria

Colletotrichum sp. Merupakan endofit yang diisolasi dari tanaman

Artemisia annua, menghasilkan metabolit artemisinin yang sangat

potensial sebagai anti malaria (Lu H., et.al. 2000). Disamping itu

beberapa mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman Cinchona spp,

jugamampu menghasilkan alkaloidcinchona yang dapat dikembangkan

sebagai sumber bahan bakuobat anti malaria (Simanjuntak,et.al. 2002).

4. Endofit yang memproduksi antioksidan

Pestacin dan isopestacin merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh endofit P.microspora. Endofit ini berhasil diisolasi dari

tanaman Terminalia morobensis, yang tumbuh di Papua New Guinea.

Baik pestacin ataupun isopestacin berhasiat sebagai antioksidan, dimana aktivitas ini diduga karena struktur molekulnya mirip dengan flavonoid (Strobel, et.al. 2002)

2.3 Biotransformasi

Biotransformasi adalah proses yang dilakukan oleh mikroorganisme atau enzim untuk merubah suatu senyawa menjadi suatu produk dengan kerangka dasar yang mirip. Reaksi yang terjadi dikatalis oleh enzim yang dihasilkan oleh sel mikroba. Kebanyakan enzim tersebut dibutuhkan untuk fungsi normal dalam kehidupan mikroba seperti metabolisme dan reproduksi. (Rosazza, 1982). Biotransformasi ini digunakan pada banyak kasus untuk meningkatkan aktivitas biologik dari suatu struktur kimia dan biasanya melibatkan aksi dari salah satu atau beberapa enzim yang digabungkan dalam sequence untuk melakukan suatu reaksi kimia khusus. (Surodjo, 2008). Agar proses biotransformasi dapat berhasil, diperlukan berbagai persyaratan diantaranya kultur harus mempunyai enzim utama untuk mengubah dari prekusor ke produk. Produk yang dibentuk harus lebih cepat untuk menghindari dimetabolisme lebih lanjut, dan kultur harus toleransi dengan substrat yang ditambahkan juga produk yang dihasilkan.

Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa suatu mikroba endofit dapat melakukan proses biotransformasi metabolit sekunder yang ada pada tanaman inangnya, diantaranya adalah :

• Fungi endofit Xylaria sp. yang diisolasi dari Chincona pubescence

dilaporkan dapat mengubah alkaloid kina menjadi turunan 1-N-oksida yang memiliki efek sitotoksik lebih rendah dibanding

melibatkan reaksi oksidasi yang menggunakan molekul oksigen yang dikatalisasi oleh endoenzim (Shibuya, et al . 2002).

Gambar 2. Reaksi biotransformasi kuinin oleh jamur endofit Xylaria sp yang diisolasi dari tumbuhan kina.

• Lima senyawa yang telah diisolasi dari tumbuhan teh (Camelia sinensis) yaitu katekin, epikatekin, epikatekin 3 O-gallate, epilokatekin 3-O-gallate, dan galokatekin dapat mengalami biotransformasi oleh jamur endofit Diaporthe sp. Salah satu contohnya adalah senyawa (+)- catechin yang mengalami stereoselektif oksidasi pada posisi C-4, berubah menjadi (+)-(2R,3S,4S)-3,4,5,7,3’,4’ hexahydroxyflavan. (Agusta, et al. 2005).

• Senyawa (+)-epigalokatekin-3-O-gallat dilaporkan dapat mengalami biotransformasi menjadi (-)-2R,3S-Dihidromirisetin oleh fungi

endofit Diaporthe sp yang diisolasi dari tumbuhan teh. Proses

biotransformasi tersebut terjadi melalui tiga tahapan reaksi.Reaksi tahap pertama adalah reaksi hidrolisis untuk melepaskan gugus galoil menjadi (-)- GCG (galokatekin galat) dan asam galat. Reaksi tahap kedua adalah reaksi oksidasi gugus metilen C-4 menjadi 4-hidroksi untuk menghasilkan produk minor. Dan pada reaksi tahap ketiga terjadi reaksi oksidasi lanjutan pada atom C-4 untuk

kuinin _{Kuinin 1-N-Oksida}

membentuk gugus karbonil sehingga menghasilkan (-)-(2R,3S)-dihidromirisetin. (Agusta. 2007)

Reaksi biotransformasi oleh jamur endofit adalah unik dan spesifik. Salah satu contohnya adalah reaksi biotransformasi yang terjadi pada (+)-epigalokatekin-3-O-gallat oleh jamur Diaporthe sp, dimana pada peningkatan suhu inkubasi sampai 30°C tidak menghasilkan produk (-)-2R,3S-dihidromirisetin. Akan tetapi jika suhu diturunkan sampai 10°C , reaksi dapat berlangsung dan menghasilkan produk. Selain itu factor cahaya juga sangat berpengaruh terhadap reaksi biotransformasi tersebut. Pada kondisi ruangan yang terang pada siang hari reaksi biotransformasi tidak berlangsung, karena reaksi tersebut berjalan pada kondisi gelap. (Agusta, 2007). Contoh lain yang menunjukan bahwa reaksi biotransformasi itu adalah spesifik adalah yang diperlihatkan oleh jamur endofit Diaporthe sp yang hanya bisa melakukan biotransformasi senyawa katekin alami yang terdapat pada tumbuhan inangnya. Karena turunan katekin dengan konfigurasi 2S- fenil yang merupakan senyawa artefak yang bukan komponen kimia alami teh, tidak menunjukan berlangsungnya reaksi biotransformasi. (Agusta , et al. 2005).

Pada proses biotransformasi, jamur endofit berperan sebagai katalis dimana jamur akan mengeluarkan suatu enzim yang dapat merubah struktur suatu senyawa kimia. Enzim akan bekerja baik apabila jamur endofit tersebut mendapatkan nutrisi yang baik pula. Sehingga pemilihan medium yang cocok sangat mempengaruhi proses biotransformasi

pertumbuhan jamur pun akan baik dan dapat berpengaruh terhadap produksi enzim yang dihasilkannya.

Selain itu penambahan substrat juga mempengaruhi jalanya reaksi biotransformasi. Contohnya pada biotransformasi kina oleh jamur Xylaria sp tidak berjalan dan tidak menghasilkan produk biotransformasi dengan penambahan substrat yang sekaligus banyak (20 mg). Sebaliknya substrat yang ditambahkan secara bertahap dari jumlah yang sedikit (2mg) kemudian beberapa hari kemudian ditambahkan lagi sebanyak 20 mg, memperlihatkan jalannya reaksi biotransformasi (Shibuya, 2003). Sehingga agar proses biotransformasi dapat berjalan maka perlu dicari kondisi yang cocok untuk jamur tersebut, karena pada dasarnya setiap jamur memiliki karakter yang spesifik dan unik untuk dapat melakukan reaksi biotransformasi.

Proses biotransformasi memiliki banyak keuntungan diantaranya, biotransformasi dengan kultur sel tanaman bersifat enzimatis sehingga reaksinya selektif dan spesifik. Selain itu dalam proses tersebut dihasilkan senyawa baru, dimana senyawa tersebut tidak mungkin dihasilkan dalam proses yang normal, didapatkan senyawa baru yang unik aktivitas biologinya, punya efek farmakologi, senyawa baru yang dihasilkan memiliki harga yang lebih tinggi (mahal), dan senyawa yang lebih baik dari senyawa awalnya, baik dalam hal stabilitasnya atau pun kelarutan. Namun disamping keuntungan yang diperoleh, biotransformasi pun memiliki beberapa kelemahan diantaranya teknik ini sulit dan rumit untuk dilakukan dan peralatan yang dibutuhkan cukup mahal.

2.4 Palmatin

Gambar 3. Struktur Molekul Palmatin

Palmatin adalah isoquinoline alkaloid yang memiliki rumus molekul C21H22NO4 dengan bobot molekul m/z 352.4 (Chen, et al. 1999). Palmatin ditemukan dibeberapa tumbuhan menispermaceae yang salah satunya ada pada tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr) .Di Cina, protoberberin alkaloid ini sudah banyak digunakan untuk pengobatan demam, diare dan malaria serta digunakan pula sebagai antiradang dan penyakit infeksi lainnya seperti infeksi saluran cerna, infeksi kemih dan lainnya. (Mingming. et al. 2007 ) . Beberapa penelitian lainnya pun telah banyak membuktikan bahwa palmatin merupakan alkaloid yang memiliki berbagai aktivitas farmakologi yang cukup baik seperti antibakteri dan antiinflamasi . Palmatin dilaporkan pula memiliki aktivitas yang baik digunakan untuk penyakit hepar (Wang. 2003). Dan penelitian baru-baru ini juga melaporkan bahwa alkaloid palmatin memiliki aktivitas yang baik untuk mengurangi iskemia (Kim. et al .2009)

BAB III

KERANGKA KONSEP

Dilakukan penelitian mengenai biotransformasi senyawa palmatin tersebut

oleh isolat jamur AFKR-3 dari tumbuhan Arcangelisisa flava L.Merr yang

sebelumnya telah diketahui mampu melakukan biotransformasi berberin.

Medium tumbuh jamur (medium PDB)

Identifikasi senyawa F-4 yang diduga merupakan senyawa palmatin yang sebelumnya telah diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L.Merr )

Isolat jamur AFKR-3 pada medium PDA yang berumur 4 hari

Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3

Scaling up biotransformasi palmatin

Penyiapan metode penelitian, alat serta bahan yang akan digunakan

Senyawa palmatin yang

diisolasi dari Arcangelisia

flava L . Merr

Ekstraksi, Partisi, Fraksinasi , Purifikasi dan Karakterisasi Hasil Biotransformasi

Analisa Data

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 hingga bulan Juni 2010 bertempat di Laboratorium Fitokimia, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.

4.2 Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Rotary Evaporator, Syringe Driven Filter Unit (Miller GP) ukuran 0.22 µm,

test tube mixer (Vortex Sibata), vial, UV cabinet, chamber, petridish, , lemari asam, neraca analitik, Laminar Air Flow (LAF), pipa kapiler, autoklaf, micropipet, tabung reaksi, rak tabung reaksi, shaker, pipet tetes, gelas ukur, beker glass, vial, ampul, mikrotiter plate, kromatografi kolom, erlenmeyer, inkubator shaker, refrigerator, HPLC (Shimadzu LC-20 ab), LCMS (LCT Premier XE).

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat senyawa alkaloid Arcangelisia flava L. Merr (palmatin), isolat jamur AFKR-3, plat TLC (TLC silica gel 60 F254), sephadex LH-20, metanol, diklorometan, asam asetat glasial, reagen dragendorf, vanilin, amoniak 25%, Ce(SO4)2, aquades, isopropanol, etil asetat, n-hexan, metanol

90%, etanol 70%, asetonitril, air miliphore, aquabides, larutan dimetil sulfoksida, (DMSO), medium Potato Dextro Broth (PDB), medium

Potato Dextro Agar (PDA).

4.3 Metode Penelitian

Kegiatan yang dilakukan untuk mencapai sasaran :

1. Penyiapan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Identifikasi Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr 3. Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3

4. Scaling up biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 5. Ekstraksi hasil biotransformasi

6. Partisi ekstrak hasil biotransformasi

7. Fraksinasi ekstrak hasil biotransformasi dengan kromatografi kolom 8. Purifikasi fraksi hasil biotransformasi dengan TLC preparatif

9. Karakterisasi senyawa hasil biotransformasi dengan spektoskopi massa

4.4 Prosedur Kerja

4.4.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Akar Kuning

(Arcangelisia flava L. Merr)

Untuk identifikasi isolat fraksi 4 Arcangelisia flava.L Mer yang diduga sebagai senyawa palmatin dilakukan dengan membandingkan fraksi 4 tersebut dengan standar palmatin HCl. Identifikasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) , HPLC dan spektroskopi massa. Sebelum dilakukan KLT senyawa palmatin HCl terlebih

dahulu dipreparasi untuk mendapatkan palmatin bebas. Palmatin HCl dilarutkan dengan diklorometan : air (1:1) kemudian ditambahkan NH4OH, dikocok dan didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan diklorometan diambil dan dipekatkan. Selanjutnya ekstrak diklorometan dan fraksi 4 dari Arcangelisia flava. L. Merr dianalisis dengan KLT, dimana fase gerak yang digunakan adalah diklorometan : metanol (6 : 1) dengan penambahan 1 tetes asam asetat glasial. Untuk analisis HPLC, kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm. Dan untuk analisis dengan spektoskopi massa digunakan LCMS LCT Premier XE.

4.4.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

Dalam penelitian ini strain jamur yang digunakan adalah salah satu isolat jamur filament yang sebelumnya telah diisolasi dari akar kuning

Arcangelisia flava (L) Merr yaitu jamur AFKR-3. 1. Pembuatan Medium Kultivikasi

Sebanyak 2.4 g medium PBD difco dilarutkan dengan 100 mL air sumur ke dalam erlenmeyer 300 ml , kemudian diaduk hingga melarut. Erlenmeyer ditutup dengan karet silikon dan selanjutnya medium tersebut disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121°C selama 20 menit.

2. Kultivasi Jamur Endofit

Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium Potato Dextro Agar /PDA dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke dalam medium PBD (Potato Dextro Broth) yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan. Kultivasi jamur endofit ini di kerjakan dalam LAF (Laminar Air Flow) . Medium PDB yang telah berisi jamur endofit tersebut kemudian dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.

3. Penambahan Substrat pada Kultur

Substrat yang ditambahkan pada kultur adalah alkaloid F-4 yang telah diisolasi dari Arcangelisia flava L. Merr (senyawa palmatin). Penambahan substrat dilakukan bertahap sebanyak 2 kali, penambahan yang pertama dilakukan setelah 1 hari kultivasi atau setelah jamur berumur 1 hari. Sedangkan penambahan substrat yang kedua dilakukan tiga hari kemudian, setelah 4 hari kultivasi. Substrat yang ditambahkan harus dalam keadaan steril, sehingga dilakukan filtrasi menggunakan Syringe Miller GP dengan dimeter pori 0.02 µm. Penyaringan dilakukan dalam keadaan steril di Laminar Air Flow. Untuk penambahan substrat yang pertama, sebanyak 1 mL filtrat dengan konsentrasi 10 % metanol dalam 1 mg/ mL dipipet dan kemudian masing-masing dimasukan ke dalam kultur jamur endofit. Dan untuk penambahan substrat yang kedua, sebanyak 10 ml substrat (1 mg/ mL metanol ) dipipet dan dimasukan ke dalam kultur jamur.

Selanjutnya kultur jamur dan substrat dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.

4. Monitoring Hasil Biotransformasi

Dalam monitoring hasil biotransformasi dilakukan penyamplingan terhadap kultur jamur AFKR-3 yang telah ditambahkan substrat. Sampling pertama dilakukan setelah 24 jam penambahan substrat pada kultur jamurtersebut . Penyamplingan dilakukan dengan memipet 5 ml substrat + kultur yang ada dalam erlenmeyer kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu diekstraksi dengan pelarut dikrlorometan : metanol dengan perbandingan 5:1 sebanyak 5 ml. Selanjutnya campuran tersebut di vortex dan didiamkan beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evap dan diuapkan. Ekstrak kental kemudian di monitoring dengan TLC (absorben : silica gel dan eluen diklorometan: metanol (6:1) dengan penambahan asam asetat glasial 1 tetes. Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm , dan kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf.

4.4.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

1. Pembuatan Medium Kultivasi

Sebanyak 24 gram medium PDB difco dilarutkan dalam 1 liter air. Setelah semua komponen melarut, medium tersebut dibagi ke dalam 5 erlenmeyer 500 mL masing-masing sebanyak 200 mL dan ditutup

dengan karet silikon. Selain itu di buat pula medium PDB untuk kontrol . Keenam erlenmeyer tersebut kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 °C selama 20 menit.

2. Kultivasi Jamur Endofit AFKR-3

Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium PDA ( Potato Dextro Agar ) dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke dalam 6 erlenmeyer yang berisi medium PDB yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan . Pengerjaan kultivasi ini dilakukan dalam keadaan steril di LAF (Laminer Air Flow). Medium PDB yang telah berisi jamur endofit kemudian dishaker pada temperatur 27 °C dengan kecepatan 120 rpm.

3. Penambahan Substrat pada Kultur

Substrat yang ditambahkan adalah senyawa palmatin. Penambahan substrat dilakukan bertahap sebanyak 2 kali, penambahan yang pertama dilakukan setelah jamur berumur 1 hari setelah kultivasi. Sedangkan penambahan substrat yang kedua dilakukan setelah 4 hari kultivasi. Substrat di tambahkan pada kelima erlemeyer yang telah berisi medium dan jamur, sedangkan untuk medium kontrol tidak diberikan substrat. Substrat yang ditambahkan harus dalam keadaan steril, sehingga dilakukan filtrasi menggunakan Syringe Miller GP

dengan dimeter pori 0.02 µm. Penyaringan dilakukan di Laminar Air Flow. Untuk penambahan substrat yang pertama, sebanyak 2 mL substrat dengan konsentrasi 1 mg/ mL methanol dipipet dan

kemudian masing-masing dimasukan ke dalam kultur jamur endofit. Dan untuk penambahan substrat yang kedua, sebanyak 20 ml substrat mg (1 mg / mL metanol ) dipipet dan dimasukan ke dalam kultur jamur. Kemudian keenam erlenmeyer tersebut dishaker kembali pada temperatur 27 °C dengan kecepatan 120 rpm.

4. Monitoring Hasil Biotransformasi

Monitoring hasil biotransformasi dilakukan dengan penyamplingan terhadap kultur jamur AFKR-3 yang telah ditambahkan substrat palmatin . Sampling dilakukan setelah 6 hari penambahan substrat pada kultur jamur tersebut. Penyamplingan dilakukan dengan memipet 5 ml kultur dalam medium PDB (Potato Dextro Broth ) yang telah ditambahkan substrat, kemudian campuran tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu, campuran diekstraksi dengan dikrlorometan : metanol dengan perbandingan 5:1 sebanyak 5 ml. Campuran tersebut divortex dan didiamkan beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah kemudian dipipet dan dipindahkan ke labu evap dan dipekatkan . Ekstrak pekat kemudian dimonitoring dengan KLT (absorben : silica gel dan eluen: diklorometan:metanol ( 6 : 1) yang ditambahkan 1 tetes asam asetat glasial). Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm dan kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf.

4.4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

pada medium PDB (Potato Dextro Broth)

Setelah 14 hari dari penambahan substrat, kultur jamur AFKR-3 beserta biomassanya diekstrak dengan pelarut diklorometan : metanol ( 5 : 1 ) . Jamur dan biomassa dalam medium PDB terlebih dahulu di hancurkan, kemudian masing-masing ditambahkan pelarut dan di stirer selama beberapa menit. Ekstraksi dilakukan kurang lebih 3 kali. Hasil ekstraksi kemudian disaring dan filtrat dipisahkan dengan menggunakan corong pisah. Campuran di kocok selama beberapa saat, kemudian didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Selanjutnya lapisan bawah (diklorometan:metanol) diambil. Setelah itu ekstrak dikeringkan dengan rotary evaporator. Ekstrak pekat kemudian di KLT (absorben : silica gel dan eluen diklorometan-metanol = 6 : 1 yang ditambahkan 1 tetes asam asetat). Untuk perbandingan sampel palmatin di TLC pula. Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf untuk mengetahui apakah reaksi biotransformasi berjalan atau tidak . Noda yang muncul juga disemprot dengan pereaksi serium untuk mengetahui apakah banyak terkandung asam-asam lemak dari noda-noda yang muncul. Ekstrak pekat diklorometan : metanol juga dianalisis dengan HPLC Shimadzu LC-20 ab, dimana kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm.

4.4.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3 (Ekstrak Diklorometan-Metanol)

Partisi ekstrak dilakukan dengan corong pisah dengan melarutkan ekstrak pekat diklorometan:metanol dengan metanol . Selanjutrnya larutan metanol tersebut ditambahkan dengan sejumlah n-hexan, untuk kemudian dipartisi dalam corong pisah. Campuran tersebut dikocok dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah (lapisan metanol) diambil dan di pekatkan. Ekstrak pekat metanol kemudian di KLT kembali (absorben : silica gel dan eluen diklorometan-metanol = 6 : 1 yang ditambahkan 1 tetes asam asetat glasial).

4.4.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi Palmatin

oleh Jamur AFKR-3

Fraksinasi ekstrak dilakukan dengan kromatografi kolom. Ekstrak metanol diisolasi dengan menggunakan kolom kromatografi sistem isokratik dimana fasa diamnya adalah sephadex LH- 20 dan fasa geraknya metanol 90%. Ukuran kolom yang digunakan adalah 2.5 x 100 cm. Hasil isolat ditampung ke dalam tabung reaksi dan isolat dalam setiap tabung dicek dengan KLT (absorben = silika dan eluen = diklorometan-metanol = 6:1 [7 ml ] yang ditambah 1 tetes asam asetat glasial ). Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 nm dan 366 nm kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf. Jika diperoleh Rf atau noda yang sama maka isolat digabung dan dijadikan ke dalam satu fraksi.

4.4.7 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)

Dalam tahapan ini, fraksi 1 dipurifikasi dengan menggunakan KLT preparatif (adsorben : silica gel 60 F245 dengan eluennya etil asetat : isopropanol : amoniak 25 % = 8 : 8 : 5 ). Selanjutnya noda yang muncul diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Setelah itu noda yang muncul itu dikerok kemudian dilarutkan dengan diklorometan, metanol, dan kloroform, lalu disaring dengan menggunakan kertas saring. Hasil yang diperoleh dikeringkan dan kemudian di KLT dengan eluen etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8:8:1). Noda yang muncul diamati dan disemprot dengan reagen dragendorf serta dihitung nilai Rf-nya.

4.4.8 Karakterisasi Senyawa Hasil Biotransformasi

Karakterisasi hasil biotransformasi dilakukan dengan analisis menggunakan Spektroskopi Massa. Produk biotransformasi yang diperoleh diinjeksikan ke dalam LCMS LCT Premier XE dengan metode direct inlet.

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr

Dari penelitian sebelumnya telah diisolasi beberapa senyawa alkaloid dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr). Salah satu alkaloidnya adalah fraksi 4 yang diduga merupakan senyawa palmatin (Mahesa, 2009). Pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan identifikasi terhadap senyawa fraksi 4 tersebut. Identifikasi fraksi 4 dilakukan dengan analisis KLT dan HPLC serta dengan spektroskopi massa. Identifikasi dengan KLT dan HPLC dilakukan dengan membandingkan senyawa fraksi 4 dengan standar palmatin HCl. Sedangkan untuk analisis dengan spektroskopi massa, bobot molekul fraksi 4 yang diperoleh dibandingkan dengan senyawa palmatin standar yang memiliki bobot molekul m/z 352.4 (Chen, et al. 1999).

Dari profil kromatogram KLT dapat dilihat bahwa standar palmatin dan fraksi 4 memiliki spot dengan nilai Rf yang sama yaitu 0.36 . Dan gabungan senyawa fraksi 4 dengan standar palmatin HCl menghasilkan satu spot

(Gambar 4). Hal itu mengindikasikan bahwa kedua senyawa tersebut adalah senyawa yang sama. Dari hasil kromatrogram HPLC, peak yang muncul pada standar palmatin HCl dan fraksi 4 Arcangelisia flava L. Merr memiliki waktu retensi yang hampir sama yaitu pada 5.460 dan 5.456 (Gambar 5). Kedua analisis tersebut diperkuat dengan analisis spektroskopi massa, dimana dari hasil analisis tersebut diperoleh bobot molekul senyawa fraksi 4 kurang lebih adalah sama dengan standar palmatin yaitu sebesar m/z 352.14 (Gambar 6).

Gambar 4. Profil kromatogram KLT palmatin . Fasa diam = silica gel, eluen = diklorometan : metanol (6 : 1 ) dengan penambahan asam asetat glasial 1 tetes. 1 = pada panjang gelombang 254 nm, 2 = pada panjang gelombang 366 nm, 3 = setelah disemprot pereaksi dragendorf. a = standar palmatin, b=campuran F4+standar, c= F4 A.Flava.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 mV Detector A:266nm 3. 035 3. 174 3. 650 5. 460

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 mV Detector A:266nm 2. 550 3. 185 3. 809 5. 456 11. 736

Gambar 5. Profil Kromatogram HPLC palmatin. Kolom = Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor pada panjang gelombang = 266 nm. A= palmatin HCl , B = Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr.

A

B

palmatin

a b c a b c a b c 1

palmatin

Gambar 6. Hasil analisis spektroskopi massa (LCMS LCT Premier XE) fraksi 4

Arcangelisia flava L.Merr dengan metode direct inlet.

Dari hasil ketiga analisis diatas dapat dipastikan bahwa senyawa fraksi 4 yang telah diisolasi dari tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr tersebut merupakan senyawa palmatin.

5.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

Jamur endofit AFKR-3 yang diperoleh dari tumbuhan

Arcangelesia flava L. Merr telah diketahui dapat melakukan proses biotransformasi terhadap senyawa berberin di dalam medium cair (Mahesa, 2009). Dalam penelitian ini, dilakukan serangkaian penelitian untuk mengetahui apakah jamur endofit AFKR-3 dapat melakukan biotransformasi terhadap senyawa alkaloid tumbuhan Arcangelisia flava

L.Merr lainnya, yaitu palmatin. Isolat jamur AFKR-3 yang akan digunakan adalah jamur yang telah diremajakan dan berumur 3-4 hari pada medium PDA (Potato Dextro Agar).

Hasil pengamatan secara makroskopis memperlihatkan bahwa jamur endofit AFKR-3 memiliki miselium berwarna putih jika ditumbuhkan pada medium PDA, seperti terlihat pada Gambar 7. Sedangkan pada bagian belakang, koloni jamur ini memperlihatkan warna kuning yang mulai terbentuk beberapa hari setelah ditanam. Kemungkinan warna kuning ini muncul akibat ada produksi metabolit oleh jamur tersebut.

Gambar 7. Jamur AFKR – 3 yang diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr ) yang ditanam pada medium Potato Dextro Agar (PDA) setelah berumur 4 hari.

Prosedur dalam penambahan substrat pada penelitian ini, mengacu pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Shibuya et al (2005 ), dimana substrat yang ditambahkan dilakukan secara bertahap. Sejumlah substrat ditambahkan dalam jumlah yang sedikit setelah jamur berumur 1 hari, tiga hari kemudian penambahan substrat dilakukan kembali dalam jumlah yang lebih banyak. Hal itu bertujuan karena umumnya proses biotransformasi berjalan spesifik.

Dalam penelitian yang dilakukan oleh Shibuya (2005) dan Agusta 2010 (data belum dipublikasi), diketahui bahwa penambahan substrat ke dalam kultur jamur dalam jumlah yang sekaligus banyak tidak diperoleh produk biotransformasi atau dalam kata lain reaksi biotransformasi tidak

berjalan. Sebaliknya substrat yang ditambahkan sedikit kemudian banyak memperlihatkan jalannya reaksi biotransformasi. Oleh karena itu dalam penelitian ini dipilih cara penambahan substrat yang secara bertahap dan dilihat apakah proses biotransformasi berjalan atau tidak dengan memonitoring substrat yang dikultur pada jamur AFKR-3 pada medium PDB (Potato Dextro Broth).

Dalam proses monitoring biotransformasi dilakukan penyamplingan terhadap kultur jamur yang telah ditambah substrat setelah 24 jam, 1 minggu dan 2 minggu. Penyamplingan dilakukan dengan mengambil sebanyak 5 ml larutan sampel yang kemudian diekstraksi dengan pelarut diklorometan : metanol (5 : 1). Hasil monitoring dapat diamati dari noda yang muncul pada plat KLT. Pola kromatogram KLT ekstrak reaksi biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 di dalam medium PDB seperti terlihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Profil kromatogram KLT ekstrak diklorometan – metanol (5 :1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB . Fasa diam = silica gel, eluen = diklorometan : metanol : asam asetat glasial = 6 : 1 : 1 tetes. A = hasil KLT setelah 24 jam dari penambahan substrat, B = hasil KLT setelah 1 minggu dari penambahan substrat. C = hasil KLT setelah 2 minggu dari penambahan substrat. a = standar palmatin, b= sampel, c = campuran standar + sampel.

a b

a

b

a

b

a

a

c

b

a

c

b

B

A

C

Hasil monitoring 24 jam setelah penambahan substrat belum menampakan terjadinya proses biotransformasi. Hal itu tampak dari pola kormatogram KLT yang terbentuk, yaitu hanya satu spot yang identik dengan standar. Pada kromatogram KLT hasil analisis ekstrak setelah 1 minggu, terlihat munculnya spot baru di bawah substrat palmatin. Hal ini merupakan indikasi bahwa telah terjadinya proses reaksi biotransformasi palmatin oleh AFKR-3. Akan tetapi spot produk biotransformasi yang terbentuk masih kecil yang mengindikasikan bahwa masih banyak substrat palmatin yang belum dikonversi menjadi produk. Sedangkan pada hasil sampling setelah 2 minggu, pada kromatogram KLT terlihat bahwa spot

produk reaksi biotransformasi sudah tampak jelas dimana spot produk lebih besar dari spot substrat palmatin. Itu berarti dalam waktu 2 minggu, substrat palmatin telah banyak yang dikonversikan menjadi produk biotransformasinya. Dan berdasarkan data di atas itulah diketahui bahwa jamur endofit AFKAR-3 dapat melakukan proses biotransformasi palmatin menjadi suatu produk turunannya.

5.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

Untuk melakukan isolasi dan krakterisasi produk biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3, maka dilakukan scaling-up reaksi. Kultivasi dilakukan pada medium Potato Dextro Broth (PDB) dalam jumlah besar yaitu 5 x 200 ml di dalam erlenmeyer 500 ml. Substrat yang ditambahkan pun diperbanyak yaitu masing – masing 2 mg / 2 ml metanol untuk penambahan pertama (setelah 1 hari kutivasi ) dan 20 mg/ 20 ml metanol

untuk penambahan yang kedua (setelah 4 hari kultivasi). Selain itu, dibuat pula kontrol jamur yang tidak ditambahkan substrat sebagai pembandingnya. Untuk pertumbuhan jamur endofit dapat dilihat seperti pada Gambar 9.

Gambar 9. Kultur jamur endofit AFKR-3 pada medium PBD (Potato Dextro Broth) setelah 2 minggu dari penambahan substrat (palmatin). A= kultur jamur + substrat. B = kultur jamur tanpa subtrat (kontrol).

Dalam proses scaling up, dilakukan monitoring biotransformasi dengan KLT dan HPLC untuk lebih memastikan apakah reaksi biotransformasi sudah berjalan. Monitoring pada scaling up dilakukan setelah 1 minggu dari penambahan substrat. Pola kromatogram KLT ekstrak setelah 1 minggu pada monitoring scaling up hampir sama dengan monitoring pada biotransformasi, dimana spot yang terbentuk belum memperlihatkan pemisahan yang jelas dan spot produk yang terbentuk masih sangat sedikit . Sedangkan untuk hasil analisis dengan HPLC dapat dilihat seperti pada Gambar 10.

Dari hasil analisis kromatogram HPLC ekstrak setelah satu minggu dan dua minggu terlihat bahwa telah terjadi penurunan puncak substrat palmatin. Dan dipihak lain bermunculan puncak-puncak baru pada waktu retensi yang berbeda-beda (Gambar 10). Karena sangat terbatasnya jumlah

produk biotransformasi yang berhasil diperoleh, sampai saat ini belum bisa dilakukan verifikasi puncak mana yang merupakan produk hasil proses biotransformasi palmatin.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 mV Detector A:266nm 2. 590 2. 660 3. 066 3. 819 4. 226 4. 483 5. 426 6. 068 12. 640 18. 201 19. 996 25. 279 29. 257

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 mV Detector A:266nm 3. 063 3. 555 3. 819 4. 078 4. 225 4. 462 4. 694 5. 418 6. 062 7. 665 8. 084 8. 225 11. 293 12. 612 12. 958 14. 070 18. 141 19. 662 25. 980 29. 237

Gambar 10 . Kromatogram HPLC ekstrak diklorometan-metanol (5 : 1). Kolom = Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor pada panjang gelombang = 266 nm. A = ekstrak setelah 1 minggu penambahan substrat. B = ekstrak setelah 2 minggu penambahan substrat.

5.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Palmatin

Pada saat kultur jamur mencapai 2 minggu setelah penambahan substrat yang kedua, seluruh medium dan miselium kultur jamur AFKR-3 dipanen dengan cara melakukan proses ekstraksi. Pelarut yang digunakan dalam

B

A

ekstraksi adalah diklorometan : metanol (5 : 1), sama seperti pada sampling biotransformasi. Ekstrak pekat diklorometan-metanol yang diperoleh kemudian di analisis dengan teknik KLT (Gambar 11) dan HPLC (Gambar 10) untuk memastikan produk-produk yang dihasilkan.

Gambar 11. Profil kromatogram KLT ekstrak diklorometan : metanol (5 : 1) dari kultur jamur AFKR-3 pada medium PDB setelah 2 minggu . Fasa diam = silica gel, eluen = diklorometan : metanol : asam asetat glasial = 6 : 1 : 1 tetes. 1 = hasil KLT yang di amati pada 254 dan 366 nm. 2 = hasil KLT setelah disemprot serium. a = standar , b= kultur jamur+substrat , c = kultur jamur tanpa substrat (kontrol).

Dari hasil analisa dengan kromatogram KLT, pada plat KLT terdapat dua spot dimana salah satu spot merupakan spot produk biotransformasi. Selain menghasilkan produk baru yang merupakan turunan dari senyawa palmatin, dalam proses biotransformasi tersebut juga terdapat pula senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan oleh jamur AFKR-3 itu sendiri. Dari profil kromatogram KLT pada 256 nm dan setelah disemprot dengan serium nampak spot-spot yang diduga sebagai asam lemak dan metabolit lain yang lebih polar yang dihasilkan oleh jamur AFKR-3 tersebut . Hal itu diperkuat dari profil kromatogram KLT pada

a

b

_{a b c}

( 1)

b

254 nm

366 nm

₍₂₎

kontrol jamur dimana pada pengamatan dibawah sinar UV 254 nm spot

yang muncul hanya tampak pada bagian atas (non polar) saja dan pada 366 nm terlihat jelas bahwa tidak tampak spot palmatin dan turunannya. Hal itu mengindikasikan bahwa produk biotransformasi yang dihasilkan bukan merupakan hasil metabolit dari kultur jamur AFKR-3 dalam medium PBD, melainkan hasil biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3. Dimana senyawa palmatin dirubah menjadi senyawa lain turunannya oleh suatu enzim yang terdapat pada jamur AFKR-3 tersebut.

Berdasarkan kromatogram analisis HPLC pada sampel setelah 1 minggu dan 2 minggu dapat dilihat banyak peak yang muncul yang mengindikasikan banyaknya metabolit yang dihasilkan (Gambar 10). Diantara peak-peak yang muncul pada sampel diatas, peak senyawa palmatin berada pada waktu retensi 5.426 (sampel setelah 1 minggu), dan 5.418 (sampel setelah 2 minggu). Jiika dibandingkan dengan standar palmatin, pada kromatogram HPLC sampel setelah 1 minggu dan 2 minggu dapat dilihat bahwa peak palmatin mengalami penurunan yang dikarenakan munculnya peak-peak baru. Hal itu mengindikasikan bahwa sejumlah senyawa palmatin telah dikonversikan menjadi produk baru turunannya. Sehingga jumlah senyawa palmatin mengalami penurunan.

5.5 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi Palmatin

Dari profil kromatogram KLT ekstrak jamur yang disemprot serium terlihat banyak spot yang relatif lebih non polar dibanding produk biotransformasi dan palmatin (Gambar 11.2) Hal itu mengindikasikan kemungkinan masih banyak asam lemak yang terdapat pada ekstrak

tersebut. Sehinggga untuk mempermudah proses isolasi, perlu dilakukan partisi terhadap ekstrak pekat diklorometan : metanol tersebut. Ekstrak pekat terlebih dahulu dilarutkan dalam metanol dan kemudian dipartisi dengan n-hexan untuk menarik senyawa-senyawa non polar lainnya.

Dari hasil partisi diperoleh ekstrak pekat n-hexan yang dihasilkan cukup banyak yaitu sekitar 221 mg . Hal itu mengindikasikan bahwa dalam sampel terdapat banyak asam lemak dan senyawa non polar lainnya yang dihasilkan dari kultur jamur pada medium PDB. Sedangkan ekstrak metanolnya hanya 59 mg. Ekstral metanol itulah yang kemudian akan difraksinasi untuk tujuan isolasi dan untuk mempermudah dalam pengamatan senyawa alkaloid yang dihasilkan.

5.6 Fraksinasi Ekstrak Metanol Hasil Biotransformasi

Fraksinasi ekstrak metanol dilakukan dengan kromatografi kolom. Dalam proses kromatografi kolom ini, digunakan sistem isokratik dimana sebagai fase diam digunakan sephadex LH 20 dan fase geraknya adalah metanol 90%. Volume kolom sephadex LH 20 sebesar 275 ml. Isolat-isolat yang keluar ditampung dalam tabung reaksi (Gambar 12).

Gambar 12 . Hasil isolat ekstrak metanol dengan kromatografi kolom sistem isokratik . Fase diam : sephadex LH-20, Fase gerak : metanol 90%.

Dari hasil fraksinasi diperoleh 2 fraksi yang merupakan gabungan dari isolat pada tabung 2-5 (Fraksi 1) dan 6-8 (Fraksi 2). Warna fraksi yang muncul berbeda dari bening, kuning muda, kuning pekat hingga coklat bening. Untuk mencari dimana letak senyawa biotransformasi palmatin selain dapat dilihat dari warna senyawa juga dapat diperiksa dengan KLT. Dari pengamatan visual diduga larutan yang berwarna kuning memiliki senyawa-senyawa alkaloid. Sedangkan dari pemeriksaan dengan menggunakan KLT, dapat dilihat dari spot yang muncul. Pada tabung ke 1 dan 9-13 tidak memperlihatkan spot palmatin dan senyawa turunannya. Sedangkan pada isolat tabung 2-8 terdapat spot yang menunjukan senyawa alkaloid tersebut. Dari fraksi 1 (2-5) diperoleh ekstrak pekat sejumlah 9.6 mg sedangkan jumlah ekstrak pekat pada fraksi 2 (6-8) sebesar 13.3 mg. Kedua fraksi tersebut kemudian dianalisis dengan KLT , profil kromatogramnya dapat dilihat seperti pada Gambar 13.

Gambar 13 . Profil kromatogram KLT ekstrak metanol fraksi 1 dan 2 yang di KLT dengan Fasa diam = silica gel, eluen = etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8 : 8 : 5) yang diamati pada UV panjang gelombang 254 nm. Std = standar palmatin , 1 = fraksi 1, 2 = fraksi 2.

std 1 2 std 1

Produk biotransformasi

Dari kromatogram KLT diatas dapat diketahui bahwa, fraksi 1 mengalami pemisahan yang cukup jelas (terdapat 2 spot) , sedangkan untuk fraksi 2 hanya terdapat 1 spot saja. Diduga senyawa pada fraksi 2 merupakan substrat karena spot yang terbentuk memiliki Rf yang sama dengan substrat yaitu sebesar 0.4 . Oleh karena itu, untuk isolasi lebih lanjut dengan KLT preparatif digunakan fraksi 1 saja.

5.6 Purifikasi Hasil Biotransformasi (Fraksi 1)

Untuk memperoleh isolat murni, maka perlu dilakukan purifikasi terhadap hasil biotransformasi. Purifikasi dilakukan dengan menggunakan KLT preparatif, dimana tujuan dari KLT preparatif sendiri adalah untuk isolasi hingga diperoleh senyawa murni. Sebelum dilakukan preparatif, harus dipastikan eluen yang digunakan dalam pemisahan harus cocok, sehingga terjadi pemisahan yang cukup jelas. Dalam KLT preparatif ini ekstrak fraksi 1 di totolkan pada plat KLT dengan ukuran 20 x 10 cm. Dan hasil preparatif dapat dilihat seperti pada Gambar 14.

Gambar 14 . Profil kromatogram KLT preparatif ekstrak metanol fraksi 1 . Fasa diam = silica gel, eluen = etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8:8:5) sejumlah 84 ml yang diamati pada panjang gelombang UV 366 nm.

an bawah

Lapisan atas

Lapisan tengah 1

Lapisan bawah Lapisan tengah 2

Dari hasil KLT preparatif diperoleh empat lapisan (atas, tengah 1, tengah 2 dan bawah), keempat lapisan tersebut kemudian di kerok dan masing – masing lapisan diekstrak dengan diklorometan, metanol dan klorofom, tujuan adalah untuk menarik secara sempurna senyawa yang telah dipreparatif. Setelah diperoleh ekstrak pekat dalam masing-masing lapisan tersebut, keempat lapisan tersebut di KLT kembali untuk melihat apakah isolat tersebut sudah benar-benar murni. Dari hasil KLT keempat lapisan diatas diperoleh nilai Rf yang berbeda pada masing-masing lapisan seperti pada Tabel 1.

Tabel 1. Nilai Rf fraksi 1 setelah di KLT preparatif dengan etilasetat: isopropanol : amoniak 25% (8:8:1) .

No Lapisan Rf

1 Palmatin 0.4

2 Atas 0.54

3 Tengah 1 0.50

4 Tengah 2 0.52

5 Bawah 0.4

Lapisan pada tabel nomor 2, 3, dan 4 diduga merupakan produk biotransformasi yang berbeda. Hal itu dikarenakan oleh nilai Rf dari ketiga lapisan tersebut berbeda pula. Sedangkan untuk lapisan bawah (no.5) diduga merupakan substrat yang tidak dikonversikan menjadi produk. Hal itu dikarena Rf lapisan bawah memiliki nilai yang sama dengan Rf palmatin yaitu 0.4.

Dari hasil isolasi pada biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 dalam medium PDB diperoleh AFKR-3 produk biotransformasi dengan nilai Rf serta jumlah yang diperoleh seperti pada Tabel 2.

Tabel 2. Produk biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 pada medium PDB (Potato Dextro Broth ) setelah diisolasi dan dipurifikasi.

No Hasil Biotransformasi Rf Berat (mg)

1 Produk 1 (lapisan atas ) 0.54 1.6 2 Produk 2 (lapisan tengah2) 0.52 1.6 3 Produk 3 (lapisn tengah 1) 0.50 2.1

Jumlah dari ketiga produk yang diperoleh diatas sangat sedikit, hal itu dikarenakan jumlah ekstrak metanol yang dihasilkanya pun sangat sedikit . Dan untuk mendapatkan produk murni perlu dilakukan preparatif hingga diperoleh senyawa tunggal (murni) untuk kemudian dapat dianalisis strukturnya. Produk biotransformasi inilah yang kemudian dianalisis dengan Mass Spektrofotometri.

5.7 Karakterisasi Produk Biotransformasi dengan Spektroskopi Massa

Untuk mengetahui struktur produk biotransformasi serta perubahan yang terjadi dari produk tersebut maka perlu dilakukan beberapa analisis . Pada penelitian ini analisis produk hanya dilakukan dengan spektroskopi massa dan dilihat bobot molekul produk yang diperolehnya. Dikarenakan jumlah produk biotransformasi yang dihasilkan sangat terbatas, maka dipilih produk dengan jumlah paling besar untuk dianalisis (produk 3).

Gambar 15. Hasil analisis spektroskopi massa (LCMS LCT Premier XE) produk 3 dengan metode direct inlet.

Dari hasil analisis MS diatas, dapat diketahui bahwa produk 3 yang merupakan produk biotransformasi memiliki bobot molekul sebesar m/z 369.1852 (M+1), sedangkan standar palmatin yang memiliki rumus molekul C21H22NO4 + H (M+1) memiliki bobot molekul 353.1422. Jadi terdapat penambahan bobot molekul sekitar 16 amu. Dari penambahan bobot molekul tersebut diduga terdapat penambahan atom O (oksigen) pada produk biotransformasi (produk 3). Sehingga diperkirakan produk 3 memiliki rumus molekul C21H22NO5. Produk transformasi palmatin (produk 3) yang diperoleh sebesar 1.67 %

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1Kesimpulan

Dari penelitian ini dapat diambil beberapa kesimpulan, yaitu :

1. Jamur endofit AFKR-3 yang diisolasi dari tumbuhan akar kuning (Arcangelisia flava L. Merr) memiliki kemampuan dalam melakukan transformasi senyawa palmatin pada medium PDB (Potato Dextro Broth).

2. Senyawa biotransformasi terbentuk setelah 14 hari dari penambahan substrat yang kedua.

3. Dari isolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan KLT preparatif diperoleh 3 produk biotransformasi dengan nilai Rf masing-masing adalah 0.54 (P1 , 1.6 mg ) , 0.52 (P2, 1.6 mg ) dan 0.50 (P3, 2.1 mg)

4. Identifikasi P3 dengan MS memperlihatkan terjadinya penambahan BM (Bobot Molekul) sebanyak 16 amu yang diduga merupakan atom oksigen.

6.2 Saran

1) Perlu dilakukan scaling up dalam jumlah yang lebih besar untuk memperoleh produk yang lebih banyak.

2) Perlu dilakukan analisis lebih lanjut dengan UV, IR, dan NMR untuk mengetahui struktur dari ketiga produk yang dihasilkan.

3) Perlu dilakukan uji aktivitas farmakologi terhadap produk biotransformasi yang dihasilkan serta membandingkannya dengan senyawa asal, untuk mengetahui apakah produk biotransformasi lebih baik dibandingkan senyawa asalnya.

DAFTAR PUSTAKA

Agusta A, Maheara S, Ohashi A, Simanjuntak P, and Shibuya H. 2005.

Stereoselective Oxidation at C-4 of Flavans by the Endophytic Fungus Diaporthe sp. Isolated from a Tea Plant. Chem. Pharm.Bull. 53 : 1565 – 1569.

Agusta A. 2007. Biotransformasi Epigalokatekin-3-O-galat Menjadi (-)-2R,3S-Dihidromirisetin oleh Fungi Endofit Diaporthe sp. Isolat E dari Tumbuhan Teh. HAYATI Journal of Biosciences . p 150-154

Agusta A, Ohashi K, Shibuya H. 2006. Bisanthraquinone metabolites produce by the endophytic fungus Diaporthe sp. Chem Pharm Bull 54:579-582.

Agusta A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: ITB press. Hal 25-34.

Barik B.P, Tayung K, Jagadev P.N, Dutta S.K. 2010. Phylogenetic Placement of an Endophytic Fungus Fusarium oxysporum Isolated from Acorus calamus Rhizomes with Antimicrobial Activity. EJBS 2(1) : 8-16

Chen Y.R, Wen K.C, Her G.R. 1999. Analysis of coptisine, berberine and palmatine in adulterated Chinese medicine by capillary electrophoresis-electrospray ion trap mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 866 : 273-280.

Keawpradub N, Dej-adisai S and Yuenyongsawad S. 2005. Antioxidant and cytotoxic activities of Thai medicinal plants named Khaminkhruea: Arcangelisia flava, Coscinium blumeanum and Fibraurea tinctoria.

Songklanakarin J. Sci. Technol. 27 : 455-467

Coptidis Rhizoma Reduces Injury in The Rat. Food Chem Toxicol . Vol. 47. Hal : 2097-2102

Kunii. T, Kengo. K, Yoshiyuki. K, Yasushi. N, Yukuo. N and Tadashi. S. 1985.

Indonesian Medical Plants 1. New Furanoditerpenes from Arcangelisia flava L. Merr. Chem. Pharm. Bull. 32 (2) : 479 – 487

Lu H., WX. Zou, JC. Meng, J. Hu, and RX Tan. (2000). New Bioactive

metabolites produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua. Plant Sci. 151: 76-73.

Lee J. E. Lobkovsky, NB. Pliam, GA. Strobel, and J. Clardy (1995). Subglutinols

A and B: immunosuppressive compounds from the endophytic fungus Fusarium subglutinans. J.Org.Chem. 60: 7076-7077

Lampiran 1. Tabel Komposisi Medium

1.1

Tabel 3. Komposisi Medium Potato Dextro Broth (PDB)



24 g/L

No

Bahan

Jumlah

1

Potatoes infusion

200 g

2

Dextrose

20 g

3

Air Sumur

1 L

1.2

Tabel 4. Komposisi Medium Agar



15g / L

No

Bahan

Jumlah

1

Agar Powder

15 g

2

Air Sumur

1 L

1.3 Tabel 5. Komposisi Medium Potato Dextro Agar (PDA)



39 g/L

No

Bahan

Jumlah

1

Agar

15 g

2

Dextrose

20 g

3

Potato infusion

4 g

Lampiran 2. Skema Kerja

2.1

Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Arcangelisia flava L. Merr

2.1.1

Analisis dengan KLT

2.1.2

Analisis dengan HPLC

2.1.3

Analisis dengan MS

Palmatin HCl

Ekstrak diklorometan:air

Lapisan diklorometan

_{Lapisan air}

Lapisan diklorometan

Fraksi 4 A.Flava

Noda pada plat

Fraksi 4 A.Flava

Palmatin HCl

Spektrum HPLC

Fraksi 4 A.Flava

Hasil analisa MS

Diekstrak dengan diklorometan : air (1 : 1)

Ditambah NH4OH, 

divortex dan didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan

Di KLT (adsorben : silica gel, eluen : diklorometan: methanol [6:1] dengan + 1 tetes asam asetat glasial )

• Dilarutkan dengan methanol disaring dengan filter

whatman 0.4 µm  masukan dalam vial HPLC

• Kondisi HPLC : kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak

C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm

Diinjeksikan ke LCMS dengan metode direct inlet

2.2

Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

isolat jamur endofit yang

diisolasi dari

Arcangelisia

flava

L .Merr

(Jamur AFKR-3)

Kultur jamur AFKR-3

pada medium PDB

Kultur jamur AFKR-3 pada

medium PDB setelah dishaker

Kultur jamur AFKR-3 +

substrat setelah 3 hari

dari penambahan

substrat pertama

Monitoring hasil

biotransformasi

Ekstrak pekat

Noda pada plat

dikultur pada100 ml medium PBD

(dikerjakan di dalam LAF)

dishaker selama 1 hari pada suhu 27°C dengan kecepatan 100 rpm

Penambahan substrat pertama :

• + 1 mL larutan palmatin (1mg/ml)

• dishaker kembali pada suhu 27°C

dengan kecepatan 120 rpm

Penambahan substrat kedua :

• + 10 mL larutan palmatin (1mg/ml)

• dishaker kembali pada suhu 27°C

dengan kecepatan 120 rpm

Penyamplingan dilakukan setelah 24 jam, 1 minggu dan 2 minggu dari penambahan substrat kedua :

• Pipet 5 ml kultur jamur endofit

• + diklorometan-metanol (5:1) sebanyak 5 ml

• Vortex  ambil lapisan bawah  pekatkan

• TLC (adsorben : silica gel dan eluen :

diklorometan : metanol: • as.asetat glasial = 6 :1:1 tetes

• diamati di bawah UV & disemprot dengan

2.3

Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3

Isolat jamur AFKR-3

dikultur pada 5 x 200 mL medium PDB + 1x 200 mL untuk kontrol jamur

Kultur jamur

pada medium PDB

Kultur jamur AFKR-3

Penambahan substrat pertama :

• Masing-masing kultur jamur + 2ml larutan palmatin

(mg/ml)

• Dishaker kembali dengan kecepatan 120 rpm pada

suhu 27ºC

Monitoring biotransformasi :

• Sampling dilakukan setelah 1 minggu

dari penambahan substrat kedua

• 5 ml sampel + Diklorometan : Metanol

(5:1)  divortex

Ekstrak diklorometan-metanol

Ekstrak Air

Dipekatkan dengan rotary evaporator

Ekstrak pekat

• TLC (adsorben : silica gel dan fase gerak :

diklorometan :methanol (6:1) 7 ml + 1 tetes asam asetat glasial, diamati di bawah sinar UV 254 nm & 366 nm dan disemprot dengan pereaksi dragendorf

Noda pada plat

dishaker pada suhu 27 °C dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam

Kultur jamur endofit + substrat

Setelah 3 hari dari penambahan substrat pertama dilakukan penambahan substrat kedua :

• Masing-masing kultur jamur + 20ml larutan

palmatine (mg/ml)

• Dishaker dengan kecepatan 120 rpm, pada 27ºC

Kultur jamur endofit + substrat

2.4

Ekstraksi Hasil Biotransformasi

Jamur AFKR-3 + substrat dalam medium PDB

Ekstraksi sampel setelah 2 minggu :

• Jamur beserta biomassa dihancurkan dengan

batang pengaduk

• Diekstrak 3 kali dengan penambahan pelarut

diklorometan : methanol ( 5 : 1) , distirrer sampai homogen

Ekstrak + pelarut

Disaring dengan kapas

Filtrat (pelarut + medium)

Dipartisi dengan corong pisah, di kocok-kocok  didiamkan ada terbentuk 2 lapisan

Ekstrak diklorometan-metanol

Ekstrak Air

Dipekatkan dengan rotary evaporator

Ekstrak pekat

Spektrum-spektrum HPLC

TLC

• Dilarutkan dengan methanol disaring

dengan filter whatman 0.4 µm 

masukan dalam vial HPLC

• Kondisi HPLC : kolom yang digunakan

adalah Capcell-Pak C-18 (Shiseido, 250 x 4.6 mm). Eluent = asetonitril : air (10:90). Flow rate : 1.0 mL/min. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm

• TLC (adsorben : silica gel dan fase gerak : diklorometan :methanol (6:1) 7 ml + 1 tetes asam asetat glasial ) , diamati di bawah sinar UV 254 nm & 366 nm dan disemprot dengan pereaksi dragendorf

HPLC

2.5

Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi

2.6

Fraksinasi, Purifikasi dan Karakterisasi Hasil Biotransformasi

Ekstrak pekat diklorometan-metanol

Dilarutkan dengan methanol, kemudian dipartisi dengan pelarut n-hexan

dievap hingga terbentuk ekstrak pekat

Lapisan

n

-hexan

Lapisan metanol

Ekstrak

n

-hexan

Poduk Biotransformasi

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

•Dipurifikasi dengan KLT preparatif

•Fasa diam : silica gel 60 F245

•Eluen : etil asetat : isopropanol : amoniak 25% (8 : 8 : 1)

F

1

F

2

Ekstrak metanol

Ekstrak metanol

•Fraksinasi dengan Kromatografi kolom

sistem isokratik

•Fasa diam : sephadex LH-20

•Eluen : methanol 90%

•Ukuran kolom 2.5 x 100 cm