3.4.3. Proses Ekstraksi
Daun insulin awalnya di blender, kemudian diayak sehingga didapatkan serbuk daun insulinyang halus. Kemudian serbuk daun
insulin dilarutkan dengan ethanol 70 dengan prinsip perbandingannya 10 mg serbuk dilarutkan dengan 100 ml ethanol 70. Proses ini
dilakukan di lab riset Hasil larutan tersebut kemudian diaduk dengan hot plate stirer
selama 5 jam. Proses pengadukan dilakukan di lab riset dan lab biokimia.Hasil adukan tersebut kemudian disaring dengan saringan
mikro. Ekstrak cair tersebut kemudian dievaporasi di PAU Institut
Pertanian Bogor. Dan didapatkan ekstrak kering daun insulin.
3.4.4. Adaptasi Hewan Sampel
Sampel diadaptasikan di Animal house pada hari pertama sampai hari kedua puluh satu. Sampel diadaptasikan terhadap tempat tinggal
barunya, pemberian makanan maupun pemberian minuman. Perlakuan disamakan pada semua tikus.
Menurut referensi adaptasi cukup selama 7 hari
15
. Adaptasi ini bertujuansemua obyek penelitian tidak dalam kondisi stress dan dalam
kondisi yang sama saat dimulai penelitian.
3.4.5. Induksi Aloksan
Pada hari ke-22 tikus diinduksi aloksan 150 mgkgbb secara intraperitoneal. Setelah hewan diinduksi, diberi makanan yang cukup ad
libitum dan dalam waktu 72 jam pertama dalam air minumnya ditambahkan 40 larutan D-glukosa monohidrat untuk mencegah
terjadinya hipoglikemi yang fatal. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan 7 hari setelah induksi. Pada penelitian kami, pengukuran
dilakukan di hari ke-29. Tikus dengan glukosa 200 mgdl dikatakan sebagai tikus DM.
3.4.6. Pemberian Ekstrak Daun Insulin Terhadap Tikus
Setelah tikus dinyatakan DM, dilakukan pemberian ekstrak daun insulin Smallanthus sonchifolia selama 14 hari hari ke-29 sampai 42
dengan dosis 300 mgkgBBhari pemberian secara oral dengan menggunakan alat sonde. Alasan peneliti memakai ekstrak daun insulin
dijelaskan dalam bab I. Dosis dan lama pemberian ini diambil berdasarkan penilitian
sebelumnya yaitu menggunakan dosis 400 mgkgBB selama 14 hari secara signifikan dapat menurunkan glukosa darah pada tikus diabetes.
6
Peneliti mencoba dengan dosis lebih rendah yaitu 300 mgkgBBhari dengan lama pemberian 14 hari.
3.4.7. Pengukuran Sampel
3.4.7.1. Berat Badan
Agar mendapatkan nilai perbandingan berat badan tikus sebelum dan sesudah pemberian ekstrak, maka sebelum tikus dinyatakan DM,
berat badan harus diukur dan selanjutnya baru boleh diberikan ekstrak. Selanjutnya berat badan tikus diukur selama 14 hari sejak diberikan
ekstrak tersebut.
3.4.7.2. Glukosa Darah Sewaktu
Kadar glukosa darah diukur dua kali, yaitu sebelum pemberian ekstrak dan terakhir saat pemberian ekstrak selesai setelah 14 hari.
Yang diukur adalah glukosa darah sewaktu tikus. Pertama, kita harus membius tikus terlebih dahulu menggunakan larutan ether sampai tidak
sadarkan diri. Hal ini dilakukan agar mengurangi rasa sakit yang dialami tikus. Kemudian, dilakukan pemotongan pada ekornya. Setelah dilakukan
pemotongan, darah akan keluar dan diteteskan pada strip pengukur glukosa darah dan dilihat hasilnya di glukometer
3.4.7.3. Trigliserida
Kadar trigliserida dihitung di akhir perlakuan. Tikus yang telah dibius dengan ether hingga hampir mati, dibedah, kemudian diambil
darahnya dari vena cava inferior jantung sebanyak 3 cc. Darah tersebut disimpan terlebih dahulu di tabung EDTA agar darah tidak terjadi
koagulasi. Teknik pengambilan darah juga dengan teknik yang benar sehingga darah yang diambil tidak lisis.
Kemudian dilanjutkan
proses sentrifugasi,
yaitu dengan
memindahkan terlebih dahulu darah dari tabung EDTA ke tabung effendorf sebanyak 1,5 ml. Sentrifugasi dilakukan selama 15 menit
dengan kecepatan 3000 rpm. Proses sentrifugasi ini untuk mendapatkan plasma, plasma ini yang diukur dengan kit pengukur kadar trigliserida.
Kit dalam penelitian ini adalah jenis sclavo, perhitungan setiap sample dilakukan dua kali duplo, sehingga didapatkan variasi data
untuk kemudian ditentukan rata-rata. Setiap tabung terdiri dari
6 μL serum sampel yang selanjutnya dicampur dengan 600 μL reagen trigliserida. Kemudian dikocok hingga
homogen, dan dibaca di alat spectrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm.
3.5. Alur Penelitian
Penilaian kadar trigliserida menggunakan spektrofotometer
Didapatkan : 1.
GDS hari ke-42 mgdL 2.
Rasio berat badan hari-42 hari-29 3.
Kadar trigliserida mgdL Hari-29 = hari pengukuran ke-1
Hari-42 = hari pengukuran ke-14 Analisa statistik pada data
Tikus tiba di Animal House
Hari 1
Adaptasi selama 3 minggu Makan dan minum ad libitum
Hari 1-21 Kelompok N normal
,
Gula darah 200 mgdl Hari 22
Tikus yang diinduksi aloksan
Gula darah 200 mgdl Induksi aloksan 150 mgkgbb
Hari 22 Kelompok D DM
tanpa terapi
Gula darah 200 mgdl Mengukur berat badan
Hari 29 Kelompok D+Ss DM dengan
terapi ekstrak Smallanthus
sonchifolius. Gula darah 200 mgdl. Mengukur berat badan
Hari 29
Sonde oral ekstrak Smallanthus sonchifolius 300 mgkgbbhari,
dilarutkan dengan aquades.
Hari 29-42
Sacrifice
Sacrifice, pembiusan dengan ether dan pengambilan darah
dari vena cava inferior
Hari 43
Darah kemudian disentrifugasi, didapatkan plasma selanjutnya
dicampur dengan kit trigliserida Mengukur berat badan
Hari 29
Mengukur gula darah, dari darah vena ekor
menggunakan glukometer
Hari 42
Mengukur berat badan
Hari 42
3.6. Managemen Data
Dalam pengambilan data untuk penelitian ini, dilakukan eksperimen langsung terhadap tikus jenis ”Sprague-Dawley” dengan berat badan 170-
200 gram , yang telah diberi perlakuan sebelumnya berupa pemberian aloksan dan ekstrak daun insulin Smallanthus sonchifolia. Ditambah
dengan pencarian literatur dan melakukan peninjauan pustaka untuk mendapatkan informasi mengenai pengaruh daun insulin Smallanthus
sonchifolia terhadap kadar glukosa darah, berat badan dan kadar trigliserida. Setelah data terkumpul, dilakukan pengolahan data secara
komputerisasi yaitu dengan SPSS versi 16.0. Uji yang digunakan adalah Uji Oneway Annova karena penelitian ini
termasuk analitik kategorik numerik dan tidak berpasangan. Untuk melakukan uji Oneway Annova, terlebih dahulu dilakukan uji normalitas
data dan uji homogenitas. Jika salah satu uji tersebut tidak terpenuhi maka dilakukan transformasi data. Ketika uji transformasi data tidak berhasil
maka dilakukan uji Kruskal Wallis.
27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses pengelompokan hewan coba penelitian tidak secara random sampling, namun menggunakan teknik consecutive sampling yaitu berdasarkan
tingginya kadar gula darah setelah diinduksi aloksan, sampel dengan kadar gula tertinggi dimasukkan kelompok terapi dengan tujuan dapat terlihatnya pengaruh
pemberian ekstrak secara nyata.
4.1. Glukosa Darah Sewaktu
Data glukosa darah yang diambil adalah jumlah rata-rata mean dari glukosa darah yang diambil pada hari ke-1, ke-7 dan ke-14 masing-masing
kelompok. Data yang didapatkan selama penelitian adalah sebagai berikut :
Tabel 4.1. Rata-rata dan Standar Deviasi Glukosa Darah Tikus Setiap Kelompok Penelitian
Kelompok Glukosa Darah
Sewaktu hari ke-1 Glukosa Darah
Sewaktu hari ke-7 Glukosa Darah
Sewaktu hari ke-14 N
132,75±18,02 120,75±29,51
136,75±13,67 D
540,25±54,63 430±220,76
536,25±84,94 D+Ss
487,25±119,15 407,25±185,27
345,75±103,25 Keterangan : N, kelompok normal N=4, D, kelompok diabetes N=4, D+Ss, kelompok
diabetes dengan terapi Smallanthus sonchifolia N=4 p 0,05
p value 0,01 p value 0,05
Grafik 4.1 Rata-rata Glukosa Darah Tikus Setiap Kelompok Penelitian
100 200
300 400
500 600
700
1 7
14
G D
S m
gd L
Waktu Pengukuran Hari
N D
D+Ss
28
Dari Tabel 4.1 dan Grafik 4.1 didapatkan bahwa kelompok D dan D+Ss mengalami penurunan kadar glukosa darah pada hari akhir penelitian
dibandingkan pada hari awal penelitian. Persentase penurunan terbesar terdapat pada kelompok D+Ss yaitu sebesar 29, meskipun penurunan
glukosa darah kelompok terapi tidak sampai pada kadar glukosa darah normal. Pada kelompok normal didapatkan peningkatan kadar glukosa darah
sebesar 3. Selanjutnya dilakukan perhitungan statistik menggunakan One-Way
Anova untuk mengetahui signifikansi perbedaan antar kelompok. Tetapi karena distribusi data normal namun varians data tidak homogen Lampiran
3, maka perhitungan statistik dilanjutkan mentransformasi data, namun hasil data tetap tidak memenuhi syarat untuk dilakukan One-Way Anova.
Sehingga uji statisk dilanjutkan dengan menggunakan uji Kruskal-Waliis.
18
Data yang didapat adalah sebagai berikut : Tabel 4.2. Hasil Analisa Data Glukosa Darah Setiap Kelompok Penelitian
Kategori Kelompok Mean Rank
p-value Glukosa darah
N 2.50
D 10.00
0,012 D+Ss
7.00
Dari analisa data statistik Kruskal Wallis pada kadar glukosa darah sewaktu hari ke-14 didapatkan hasil seperti pada tabel 4.2. Terdapat nilai
p0.05 yang menunjukkan perbedaan glukosa darah yang bermakna pada semua kelompok. Hal ini dapat disebabkan kandungan smallanthaditepenic
acid A,B,C dan D pada daun insulin yang memiliki sifat anti-diabetik.
5
Studi sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak daun insulin dengan dosis 400 mgkgBBhari selama 14 hari dapat menurunkan kadar glukosa
darah tikus diabetes sebesar 59 dan juga didapatkan perbedaan antar kelompok penelitian yang bermakna. Dalam studi tersebut dijelaskan efek
hipoglikemik dari daun insulin melalui mekanisme jumlah dan sensisitifitas reseptor insulin yang meningkat, menurunkan degradasi insulin,
H H
H H
H H
29
meningkatkan pelepasan insulin oleh sel pankreas sehingga uptake
glukosa ke dalam jaringan otot dapat ditingkatkan.
6
4.2. Berat Badan
Data berat badan yang diambil berdasarkan rerata tikus masing- masing kelompok selama penelitian. Data yang diperoleh adalah sebagai
berikut: Tabel 4.3. Rata-rata dan standar deviasi BB Tikus Setiap Kelompok
Penelitian
BB hari ke-1 BB hari ke-7
BB hari ke-14 Rasio BB
H14 H1 x 100 N
310±50 285±35,71
330±15,49 108.735
D 245±21,79
240±51,96 240±28,28
98.3225 D+Ss
260±20 250±33,17
280±28,28 107.74
Keterangan : N, kelompok normal N=4, D, kelompok diabetes N=4, D+Ss, kelompok diabetes dengan terapi Smallanthus sonchifolia N=4
p value 0,01 p value 0,05
Grafik 4.2. Rasio Berat Badan Tikus Setiap Kelompok Penelitian Dari tabel 4.3 didapatkan adanya kenaikan terdapat peningkatan
6.45 pada kelompok N, penurunan 2,04 pada kelompok D, sedangkan terjadi peningkatan rerata berat badan sebesar 7,69 pada kelompok D+Ss.
Pada data ini dapat dilihat bahwa kelompok D+Ss terjadi peningkatan berat badan paling besar dari kelompok lain. Hal ini menunjukkan bahwa adanya
20 40
60 80
100 120
140
H14 H1 R
a si
o B
er a
t B
a d
a n
Waktu Pengukuran Hari
N D
D+Ss
ns
Kategori