BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Alat
Magnetic stirrer Wina, batangan magnet, spektrofotometer UV-1800 Shimadzu Spectrophotometer, pH meter Hanna, sonikator Branson, penunjuk
waktu stopwatch, neraca analitik Ohaus, gelas silinder berjaket Daiichi ,
membran Cellophane Tubing Seamless, alat sentrifuge Hitachi CF 16 R X II, tabung sentrifuge Pyrex, particle size analyser Vasco
γ
, scanning electron microscopy JSM-6360, lumpang dan stamfer, gelas ukur 50 ml Pyrex, beaker
glass 500 ml Pyrex, labu tentukur 100 ml Pyrex, labu tentukur 25 ml Pyrex, maat pipet 1 ml Pyrex, termostat MGW Lauda, termometer, bola penghisap,
statif, klem, pendingin balik, gelas arloji, batang pengaduk, selang air, karet, kertas perkamen dan alat-alat gelas lain.
3.2 Bahan
Amoksisilin PT. Mutifa, Bovine Serum Albumin Merck, natrium alginat 500-600 cP Wako pure chemical industries, Ltd Japan, kitosan Fukanoshi Co.,
Ltd, kalsium klorida dihidrat Merck, natrium klorida Merck, asam klorida Merck, natrium hidroksidaMerck, Tween 80 Merck, asam asetat Merck,
akuades, buffer pH asam Hanna, buffer pH netral Hanna.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pembuatan pereaksi
3.3.1.1 Pembuatan air bebas karbon dioksida
Akuades dididihkan kuat-kuat selama 5 menit atau lebih dan didiamkan sampai dingin dan tidak boleh menyerap karbon dioksida dari udara Ditjen POM,
1979.
3.3.1.2 Pembuatan larutan asam klorida 1 N
Asam klorida pekat sebanyak 82,8 ml dilarutkan dengan akuades hingga 1000 ml Ditjen POM, 1979.
3.3.1.3 Pembuatan larutan natrium hidroksida 1 N
Natrium hidroksida sebanyak 40 gram dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 1000 ml Ditjen POM, 1979.
3.3.1.4 Pembuatan larutan kalsium klorida 18mM
Kalsium klorida sebanyak 2 gram dilarutkan dalam air bebas karbon dioksida hingga 1000 mL.
3.3.1.5 Pembuatan larutan asam asetat 1 vv
Pipet 10 mL asam asetat glasial P encerkan dengan air hingga 1000 mL.
3.3.1.6 Pembuatan larutan natrium alginat 0,063 pH 4,9
Larutkan 0,0945 gram natrium alginat dalam 150 mL akuades, kemudian tambahkan HCl 1N hingga pH 4,9.
3.3.1.7 Pembuatan larutan natrium alginat 0,063 pH 6,2
Larutkan 0,0945 gram natrium alginat dalam 150 mL akuades, kemudian tambahkan HCl 1N hingga pH 6,2.
3.3.1.8 Pembuatan larutan kitosan 0,05 pH 4,6
Larutkan 0,05 gram kitosan dalam 100 mL asam asetat 1, kemudian tambahkan NaOH 1N hingga pH 4,6.
3.3.1.9 Pembuatan larutan kitosan 0,05 pH 6,2
Larutkan 0,05 gram kitosan dalam 100 mL asam asetat 1, kemudian tambahkan NaOH 1N hingga pH 6,2.
3.3.1.10 Pembuatan larutan Tween 80 0,1
Larutkan 0,1 gram Tween 80 dalam 100 mL akuades.
3.3.1.11 Medium cairan lambung buatan tanpa enzim medium pH 1,2
Larutkan 2 gram natrium klorida dalam 7 ml asam klorida pekat dan akuades secukupnya hingga 1000 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.1.12 Pembuatan natrium klorida 0,9
Larutkan 9 gram natrium klorida dalam 1000 ml air.
3.3.2 Pembuatan kurva serapan dan kurva kalibrasi amoksisilin 3.3.2.1 Pembuatan larutan induk baku amoksisilin
Ditimbang sebanyak 25 mg amoksisilin. Kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml dan dilarutkan dengan medium cairan lambung buatan pH
1,2. Dicukupkan dengan medium cairan lambung buatan pH 1,2 sampai garis tanda dan dikocok homogen. Diperoleh konsentrasi 250 mcgml 250 ppm.
3.3.2.2 Pembuatan kurva serapan larutan amoksisilin dalam medium cairan lambung buatan medium pH 1,2
Dipipet sebanyak 1,9 ml larutan induk baku, kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml. Dicukupkan dengan medium cairan lambung buatan
pH 1,2 sampai garis tanda dan dikocok homogen. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.3.2.3 Pembuatan kurva kalibrasi larutan amoksisilin dalam medium cairan lambung buatan medium pH 1,2
Larutan induk baku dibuat dalam berbagai konsentrasi yaitu 9; 11; 13; 15; 17; 19; 21; 23; 25 dan 27 ppm, dengan cara memipet larutan induk baku masing-
masing sebanyak 0,9; 1,1; 1,3; 1,5; 1,7; 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 dan 2,7 ml. Kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml dan dicukupkan dengan medium cairan
lambung buatan pH 1,2 sampai garis tanda. Dikocok homogen, kemudian diukur menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang maksimum yang
telah ditentukan sebelumnya.
3.3.3 Pembuatan kurva serapan dan kurva kalibrasi bovine serum albumin 3.3.3.1 Pembuatan larutan induk baku bovine serum albumin
Ditimbang sebanyak 100 mg Bovine Serum Albumin. Kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml dan dilarutkan dengan medium NaCl
0,9. Dicukupkan dengan medium NaCl 0,9 sampai garis tanda dan dikocok homogen. Diperoleh konsentrasi 1000 mcgml 1000 ppm.
3.3.3.2 Pembuatan kurva serapan larutan bovine serum albumin dalam medium NaCl 0,9
Dipipet sebanyak 17,5 ml larutan induk baku, kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml. Dicukupkan dengan medium NaCl 0,9 sampai
garis tanda dan dikocok homogen. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.3.3.3 Pembuatan kurva kalibrasi larutan bovine serum albumin dalam medium NaCl 0,9
Larutan induk baku dibuat dalam berbagai konsentrasi yaitu 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200 ppm, dengan cara memipet larutan induk
baku masing-masing sebanyak 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 1,75; 2; 2,25; 2,5;
3,75; 5 ml. Kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml dan dicukupkan dengan medium NaCl 0,9 sampai garis tanda. Dikocok homogen, kemudian
diukur menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang maksimum yang telah ditentukan sebelumnya.
3.3.4 Pembuatan nanopartikel 3.3.4.1
Pembuatan nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin pH 4.8
Nanopartikel alginat kitosan disiapkan dalam dua langkah yaitu pre-gelasi ionotropik dengan kalsium klorida diikuti dengan cross-linking oleh polikationik
Rajaonarivony, et al., 1993, dimodifikasi berdasarkan rasio stoikiometri pre- gelasi ideal dan waktu untuk penggabungan obat Sarmento, et al., 2005. Jadi, 7,5
ml dari larutan diteteskan selama 60 menit kecepatan 30 tetesmenit dengan spuit 1 ml ke dalam gelas beaker yang berisi 117,5 ml larutan natrium alginat 0,063
sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan 450 rpm dan diameter batangan magnet 2 cm. Amoksisilin 0,04 dan Tween 80 0,001-
0.01 terhadap jumlah larutan natrium alginat, ditambahkan ke dalam larutan natrium alginat sebelum penambahan kalsium klorida untuk menghasilkan pre-
gelasi alginat. Kemudian dalam asam asetat 1 ditambahkan setetes demi setetes dalam pre-gelasi sambil diaduk selama 120 menit kecepatan 30 tetesmenit
dengan spuit 1 ml. Kemudian dilanjutkan dengan sonikasi selama 15 menit. Hasil akhir campuran larutan alginat-kitosan menghasilkan pH 4,8 yang diukur dengan
pH meter.
3.3.4.2 Pembuatan nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung bovine serum albumin pH 4,8
Metodenya sama dengan metode pembuatan nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin metode 3.3.4.1, tapi dengan menggunakan bahan
obat bovine serum albumin dengan konsentrasi 0,04 dan menggunakan Tween 80 dengan konsentrasi 0,003.
3.3.4.3 Pembuatan nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung bovine serum albumin pH 6,2
Metodenya sama dengan metode pembuatan nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin metode 3.3.4.1, tapi dengan menggunakan bahan
obat bovine serum albumin dengan konsentrasi 0,04 dan menggunakan Tween 80 dengan konsentrasi 0,003. pH dari larutan natrium alginat dan kitosan pada
awalnya masing-masing diatur 6,2 dan 6,2 untuk menyediakan dispersi kolodial sehingga menghasilkan pH akhir 6,2.
Tabel 3.1 Komposisi formula alginat-kitosan dengan variasi konsentrasi Tween
80 dan variasi pH
Nama bahan
Formula
F1 F2
F3 F4
F5 F6
F8 F9
Amox 0,04
0,04 0,04
0,04 0,04
0,04 BSA
0,04 0,04
Natrium Alginat
0,063 0,063
0,063 0,063
0,063 0,063
0,063 0,063
Kitosan 0,05
0,05 0,05
0,05 0,05
0,05 0,05
0,05 CaCl
2
mM 18
18 18
18 18
18 18
18 Tween
80 0,0015
0,003 0,006
0,008 0,01
0,003 0,003
pH akhir campuran
alginat- kitosan
4,8 4,8
4,8 4,8
4,8 4,8
4,8 6,2
3.3.5 Pengujian ukuran partikel pada nanopartikel alginat-kitosan
Ukuran partikel pada nanopartikel alginat-kitosan dapat diukur dengan menggunakan Particle Size Analyzer PSA.
3.3.6 Pengukuran pH
pH pada sediaan nanopartikel diukur dengan menggunakan pH meter Hanna.
3.3.7 Pengujian efisiensi penjeratan obat dalam nanopartikel alginat-kitosan
Jumlah obat yang terjerat dalam nanopartikel alginat-kitosan dari formulasi yang berbeda ditentukan dengan cara sentrifugasi 30 ml dispersi
nanopartikel alginat kitosan pada kecepatan selama 90 menit. Dipipet cairan supernatan, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, kemudian dicukupkan
dengan medium yang sesuai. Jumlah obat yang terdapat dalam cairan supernatan diukur pada panjang gelombang maksimum obat panjang gelombang maksimum
amoksisilin adalah 229 nm dan panjang gelombang maksimum bovine serum albumin adalah 278 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
Efisiensi enkapsulasi dapat ditentukan dengan cara:
Efisiensi enkapsulasi = jumlah total obat tanpa dijerat
− jumlah obat yang dijerat jumlah total obat tanpa dijerat
x 100
3.3.8 Pengujian pelepasan amoksisilin secara in vitro
Pelepasan obat secara in vitro dengan metode dialisis dengan menggunakan membran selofan Cellophane Tubing Seamless dari berbagai
formulasi yang berbeda. Medium lambung buatan pH 1,2 sebanyak 100 ml dimasukkan ke dalam gelas silinder berjaket, suhu medium lambung buatan pH
1,2 diatur pada suhu 37ºC dengan menggunakan termostat selama percobaan. Batangan magnet dimasukkan ke dalam medium. Nanopartikel hasil sentrifugasi
diambil endapannya, kemudian dimasukkan ke dalam membran. Kedua ujung membran diikat dan digantungkan terhadap klem kemudian dicelupkan hingga
endapan terendam ke dalam medium. Kecepatan pengadukan diatur dengan kecepatan rpm. Pada interval waktu tertentu diambil aliquot sebanyak 2 ml
kemudian diganti dengan mediumnya dengan jumlah yang sama untuk menjaga volume medium disolusi tetap konstan. Aliquot kemudian dimasukkan kedalam
labu tentukur 10 ml dan ditambahkan dengan medium sampai garis tanda. Konsentrasi amoksisilin diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV pada
panjang gelombang 229 nm. Pengulangan dilakukan sebanyak 3 kali.
3.3.9 Pengujian pelepasan bovine serum albumin secara in vitro
Metode pengujiannya sama dengan metode pengujian pelepasan amoksisilin secara in vitro metode 2.3.8 tetapi menggunakan bahan obat bovine
serum albumin dan medium NaCl 0,9 yang diukur dengan panjang gelombang 278 nm.
termometer Statif
Klem
Alat disolusi Air keluar
kembali ke termostat Medium
Membran selofan yang berisi sampel
Air masuk dari termostat
Batangan magnet Magnetic stirrer
Gambar 3.1.
Skema uji pelepasan obat secara in vitro
3.3.10 Pengujian morfologi permukaan nanopartikel alginat-kitosan
Nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung obat dapat dilihat morfologi permukaannya dengan menggunakan Scanning Electron Microscope
SEM.
+
-
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pembuatan Nanopartikel Alginat-kitosan
Larutan natrium alginat dan kitosan disiapkan dengan cara melarutkan polimer dalam akuades. pH dalam larutan natrium alginat dibuat sampai 4,9
dengan menggunakan asam klorida 1M. Larutan kitosan disiapkan dengan melarutkan sejumlah kitosan dalam asam asetat 1. pH larutan kitosan dibuat
sampai pH 4,6 dengan menggunakan NaOH 1M. Metode yang digunakan untuk menyiapkan nanopartikel alginat-kitosan dinamakan dengan gelasi ionik. Terdapat
dua langkah dalam menyiapkan nanopartikel alginat-kitosan. Tahap pertama berupa penambahan ion kalsium ke dalam larutan natrium alginat untuk
membentuk pre-gelasi. Tahap kedua berupa penambahan larutan kitosan polikationik kedalam hasil pre-gelasi kalsium alginat untuk membuat penyalutan
kompleks polielektrolit. Bentuk kompleks poli-ionik alginat-kitosan melalui interaksi antara gugus karboksil dari alginat dan gugus amin dari kitosan Shafie
dan Hadeel, 2013. pH campuran larutan natrium alginat dan larutan kitosan menghasilkan pH
akhir 4,8. Berdasarkan penelitian Sarmento, et al., 2006, menunjukkan bahwa kisaran pH yang dipilih dapat mempengaruhi muatan yang berlawanan dari
polielektrolit untuk menyediakan pembentukan nanopartikel. Pengurangan pH dari 5,2 sampai 4,7 sedikit menurunkan ukuran partikel rata-rata pada
nanopartikel yang terbentuk, tetapi menunjukkan efek yang berlawanan dengan menurunnya pH dari 4,7 sampai 4,2 dan ukuran partikel meningkat secara
signifikan ketika pH larutan berair mencapai nilai 4. Hal ini diyakini bahwa pada kisaran pH ini, alginat mendekati nilai pKa-nya, terutama dari asam guluronat
sekitar 3,7 Haug, 1964, dan bagian dari alginat mulai mengendap dan membentuk agregat, yang dapat meningkatkan ukuran rata-rata partikel.
Kompleks nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung bovine serum albumin dibuat dengan variasi pH 4,8 dan 6,2. Pada pH 7,4 dan pH 6,8 tidak dapat
dibuat karena kitosan mengendap sehingga tidak bisa terbentuk nanopartikel alginat kitosan.
4.2 Pengaruh Konsentrasi Tween 80 Terhadap Ukuran Partikel Kompleks Nanopartikel Alginat-kitosan yang Mengandung Amoksisilin
Kompleks nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin pada formula tanpa Tween 80 formula 1 memiliki ukuran partikel yang paling
besar. Ukuran partikel nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin akan semakin kecil seiring bertambahnya konsentrasi Tween 80 yaitu pada
formula yang mengandung Tween 80 0,0015 formula 2, Tween 80 0,003 formula 3. Namun, penambahan konsentrasi Tween 80 yang lebih tinggi seperti
pada Tween 80 0,006 formula 4, Tween 80 0,008 formula 5 dan Tween 80 0,01 formula 6 dapat meningkatkan ukuran partikel. Hal ini disebabkan karena
adanya proses deaggregasi dan aggregasi partikel. Pengaruh surfaktan terhadap ukuran partikel hampir sama dengan penelitian Bangun dan Arianto, 1998,
mengenai deaggregasi dan aggregasi partikel-partikel belerang kolodial dalam air yang mengandung surfaktan. Surfaktan diadsorpsi pada antarmuka antara padatan
hidrofobik dan air. Bagian hidrofobik melekat pada permukaan nanopartikel dan bagian hidrofilik akan menjulang ke dalam air. Molekul-molekul surfaktan akan
membongkar sebagian agregat dengan mendesak antara partikel-partikel pada area
kontaknya Bangun dan Arianto, 1998. Jumlah surfaktan yang diadsorpsi adalah semakin bertambah dengan meningkatnya konsentrasi surfaktan. Sebaliknya,
setelah mencapai konsentrasi misel kritis, jumlah surfaktan yang diadsorpsi semakin menurun dengan semakin meningkatnya konsentrasi surfaktan. Terjadi
agregasi partikel-partikel di atas konsentrasi misel kritis yang disebabkan karena terlepasnya surfaktan pada permukaan partikel-partikel.
Pengaruh konsentrasi Tween 80 terhadap ukuran partikel nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin dapat dilihat pada tabel 4.1 dan
Gambar 4.1.
Tabel 4.1 Tabel pengaruh konsentrasi Tween 80 terhadap ukuran partikel
kompleks nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin
konsentrasi Tween 80 Dv10
nm Dv50
nm Dv90
nm 1071,8
2455,36 5890
0,0015 616,76
1071,8 1862,58
0,003 295,2
467,86 813,05
0,006 562,49
891,49 1479,5
0,008 776,45
1412,91 2692,25
0,01 851,36
1549,23 3091,11
4.3 Pengaruh pH Terhadap Ukuran Partikel Kompleks Nanopartikel Alginat-kitosan yang Mengandung Bovine Serum Albumin
Ukuran partikel kompleks nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung bovine serum albumin pada pH 6,2 memiliki ukuran partikel yang lebih kecil
dibandingkan dengan pH 4,8. Hal ini disebabkan karena bovine serum albumin memiliki titik isoelektrik diantara pH 4,7 dan 5,2 de wit, 1981; Fox, 2003; Kilara
dan Harwalkaer,1996; Murata, et al., 1993; Relkin, 1996; Walastra dan Jenness, 1984. Pada titik isoelektrik protein, struktur protein lebih hidrofobik, lebih
kompak, dan kurang stabil disebabkan karena tidak adanya gaya tolak-menolak inter-partikel Salgin, et al., 2006.
Pengaruh pH terhadap ukuran partikel kompleks nanopartikel alginat- kitosan yang mengandung bovine serum albumin dapat dilihat pada tabel 4.2.
1000 2000
3000 4000
5000 6000
7000
0,0015 0,003
0,006 0,008
0,01 U
k ur
a n pa
r ti
k e
l nm
Konsentrasi Tween 80
Dv10 nm Dv50 nm
Dv90 nm
Gambar 4.1 Pengaruh konsentrasi Tween 80 terhadap ukuran partikel kompleks
nanopartikel alginat-kitosan yang mengandung amoksisilin
Tabel 4.2 Tabel pengaruh pH terhadap ukuran partikel kompleks nanopartikel
alginat-kitosan yang mengandung bovine serum albumin pH
Dv10 nm
Dv50 nm
Dv90 nm 4,8
3091,11 6167,58
8513,64 6,2
234,49 426,69
813,05
4.4 Pengaruh Konsentrasi Tween 80 Terhadap Persentase Amoksisilin yang Terjerat dalam Nanopartikel Alginat – kitosan
Jumlah amoksisilin yang terjerap dalam kompleks nanopartikel alginat- kitosan pada formula tanpa Tween 80 formula 1 paling kecil dibandingkan
dengan formula lainnya yang mengandung Tween 80 formula 2-6. Semakin besar konsentrasi Tween 80 maka jumlah obat yang terjerat dalam kompleks
nanopartikel alginat-kitosan semakin besar. Menurut Shafie dan Hadeel 2013, hal ini disebabkan karena Tween 80 merupakan surfaktan non-ionik yang
ditambahkan sebagai agen pensolubilisasi,yang dapat menurunkan tegangan permukaan polimer, sehingga meningkatkan efisiensi enkapsulasi.
Pengaruh konsentrasi Tween 80 terhadap persentase amoksisilin yang terjerat dalam kompleks nanopartikel alginat-kitosan dapat dilihat dalam tabel 4.3
dan gambar 4.2.
Tabel 4.3 Tabel pengaruh konsentrasi Tween 80 terhadap persentase amoksisilin
yang terjerat dalam kompleks nanopartikel alginat-kitosan konsentrasi
Tween 80 penjeratan
1 penjeratan
2 penjeratan
3 penjeratan
rata-rata 4,76
4,96 5,14
4,95 0,0015
6,81 7,18
7,09 7,03
0,003 8,01
7,99 9,06
8,35 0,006
9,32 9,12
9,55 9,33
0,008 9,12
9,26 10,3
9,56 0,01
11,23 11,59
12,31 11,71
4.5 Pengaruh pH Terhadap Persen Penjeratan Bovine Serum Albumin dalam Kompleks Nanopartikel Alginat-kitosan
Jumlah bovine serum albumin yang terjerat dalam kompleks nanopartikel alginat-kitosan pada pH pembuatan 4,8 lebih besar dibandingkan pH pembuatan
6,2. Hal ini disebabkan karena pada pH 4,8 - 5,2 merupakan titik isoelektrik pada bovine serum albumin, menyebabkan protein menjadi lebih mudah beragregasi
membentuk molekul yang lebih besar, sehingga menyebabkan protein lebih mudah dijerat dalam kompleks polimer alginat-kitosan.
Pengaruh pH terhadap persentase bovine serum albumin yang terjerat dalam kompleks nanopartikel alginat-kitosan dapat dilihat dalam tabel 4.4
2 4
6 8
10 12
14
0,0015 0,003
0,006 0,008
0,01
P en
je rat
an am
ok si
si li
n
Konsentrasi Tween 80 Gambar 4.2
Pengaruh konsentrasi Tween 80 terhadap persentase amoksisilin yang terjerat dalam kompleks nanopartikel alginat-kitosan
Tabel 4.4 Tabel pengaruh pH terhadap persentase bovine serum albumin yang
terjerat dalam kompleks nanopartikel alginat-kitosan pH
penjeratan 1
penjeratan 2
penjeratan 3
penjeratan rata-rata
4,8 89,63
92,62 92,87
91,71 6,2
61,58 56,88
55,89 58,12
4.6. Uji Pelepasan Obat
Kategori