BAB 3 METODOLOGI
3.1. Desain Penelitian
Penelitian dilakukan dengan observasi klinik dengan pendekatan metode potong lintang cross sectional study.
3.2. Waktu dan tempat penelitian
Penelitian direncakan dilakukan mulai bulan Januari 2009 sampai dengan Juni 2009 di Poliklinik Endokrin dan Metabolik RS Haji Adam
Malik Medan.
3.3. Subjek penelitian
Penderita DM tipe 2 yang berobat rawat jalan di poliklinik penyakit Endokrin dan Metabolik RS HAM.
3.4. Kriteria inklusi
• Laki-laki dan perempuan berumur ≥ 18 tahun. • Pasien rawat jalan dengan penyakit DM tipe 2.
• Bersedia mengikuti penelitian.
3.5. Kriteria eksklusi
Universitas Sumatera Utara
• Penderita DM tipe 2 yang dalam keadaan komplikasi akut hipoglikemia atau hiperglikemia.
• Penderita DM tipe 2 dengan penyakit penyerta seperti infeksi, keganasan, gangren diabetik, riwayat stroke, riwayat infark
jantung koroner. • Kehamilan.
• Merokok.
3.6. Besar sampel
Perkiraan besar sampel :
36
Z α+ Zβ
S
d
d 2
n =
Z α = tingkat kemaknaan ditetapkan 95 = 1,96
Z β = 1,645
S
d
= Standart deviasi perkiraan = 0,32 d = Selisih rerata kedua kelompok yang bermakna clinical judgment
= 0,26 2
n1 = n2 ≥ 1,96 + 1,645 0,32 ≥ 19,68 ≥ 20
0,26
Jadi jumlah sampel minimal adalah 40 orang.
Universitas Sumatera Utara
3.7. Cara penelitian
a. Penelitian ini mendapat persetujuan dari komite medik penelitian bidang kedokteran FK USU.
b. Dicatat umur, jenis kelamin, riwayat hipertensi, riwayat stroke, riwayat infark otot jantung, riwayat merokok, lamanya diabetes dan
penggunaan obat –obatan. c. Diukur tinggi badan cm, berat badan kg
d. Diukur tekanan darah dengan sphygmomanometer Nova, dimana pasien dibaringkan selama 5 menit kemudian dipasang manset pada
lengan kanan dan ditentukan tekanan darah sistole dan diastole mmHg.
e. Prosedur pengambilan dan pengiriman sampel Pasien yang memenuhi kriteria inklusi, dianamnese dan diperiksa
secara fisik diagnostik oleh peneliti. Selanjutnya hasil anamnese dan pemeriksaan fisik dicatat oleh peneliti.
Kemudian dilakukan pengambilan sampel darah dari pasien dengan prosedur sebagai berikut :
1 Pertama-tama disiapkan alat-alatnya berupa: spuit, sarung tangan, Tempelkan stiker pada setiap spuit, dan tuliskan nama
pasien, serta tanggal pengambilan sampel darah. Pengambilan sampel darah dengan menggunakan plasma
EDTA. Sampel dapat disimpan sampai 24 jam pada suhu 2-8
Universitas Sumatera Utara
C. Untuk penyimpanan dalam jangka waktu lama sampai 24 bulan sampel dapat disimpan pada suhu -20
C. 2 Perhatikan apakah semua spuit sudah diberi label dan
dilengkapi, serta lembaran data telah diisi dan dikirim ke laboratorium PRODIA Jl. S.Parman no. 17233 G Medan.
f. Prosedur pemeriksaan sampel 1. Pemeriksaan KGD, HbA1c, dan ADMA dilakukan dari
sampel darah. 2. Pemeriksaan ADMA menggunakan kromatografi liquid berupa
high performance liquid chromatography HPLC. Metode ini memerlukan waktu lama.
2.1. Persiapan reagen dan sampel 2.1.1. Strip mikrotiter
MT- Strip, 12 strip, masing-masing 8 lempengan terpisah, dilapisi ADMA.
2.1.2. Buffer pencuci 50 ml 2.1.3. Reagen equalizing 1 vial
2.1.4. Reagen acylation 2 vial disertai Dimethylformamide DMF 1 vial
2.1.5. Standar A-F 6 vial, masing-masing 4 ml 2.1.6. Kontrol 1 2, masing-masing 4 ml 2 vial
2.1.7. Buffer acylation, 1 botol, 3 ml 2.1.8. Antiserum, 1 vial, 5,5 ml anti-N-acyl-ADMA kelinci
Universitas Sumatera Utara
2.1.9. Enzim konjugat, 1 vial, 11 ml, Anti- IgG peroksidase kambing-kelinci.
2.1.10. Substrat 1 vial, 11 ml solusi TMB 2.1.11. Stop Solution, 1 vial, 11 ml 0,3 M asam sulphuric
2.1.12. Piring reaksi, untuk acylation 2.1.13. Perlengkapan tambahan : pipet 20,25,50,100 dan
250 µl, pengocok orbital, perlengkapan pencucian microplate, microplate photometer 450 nm, Vortex
mixer, Roll mixer. 2.2. Prosedur test ELISA
2.2.1. Inkubasi sampel Pipet masing-masing 50 µl Standar A sampai F
terdapat 6 vial StandarA-F dalam isi Kit, 50 µl kontrol dan 50 µl sampel ke dalam strip mikrotiter yang
terlapis. Pipet tiap 50 µl antiserum dan kocok perlahan dengan pengocok orbital. Tutup lempengan
dengan adhesive foil dan inkubasi strip mikrotiter selama 15-20 jam sepanjang malam pada suhu 2-8
o
C. 2.2.2. Pencucian
Aspirasi isi lempengan dan cuci dengan 250 µl buffer pencuci, kocok perlahan dengan pengocok orbital,
diulang prosedur ini 4 kali. Pindahkan cairan sisa
Universitas Sumatera Utara
dengan menggunakan lempengan pada kertas absorben yang bersih.
2.2.3. Konjugasi inkubasi Masing-masing pipet 100 µl enzim konjugasi ke
dalam lempengan. Inkubasi 60 menit pada suhu temperatur dengan pengocok orbital.
2.3.4. Pencucian Ulang prosedur 2.2.2
2.3.5. Inkubasi substrat Pipet masing-masing 100 µl substrat ke dalam
lempengan dan inkubasi 20- 30 menit pada suhu kamar dengan pengocok orbital.
2.3.6. Stopping Pipet masing-masing 100 µl Stop Solution ke dalam
lempengan. 2.3.6. Pembacaan
Dibaca dengan densitas optikal 450 nm referensi panjang gelombang antara 570-650 nm pada
micrometer photometer.
37
3.8. Defenisi operasional
Kategori