31
3.8. Bahan dan Cara kerja 3.8.1. Bahan
- Jaringan plasenta dari pasien dengan kehamilan preeklampsia berateklampsia dan kehamilan normotensi yang dibuat parafin blok untuk
seterusnya dilakukan pemeriksaan imunohistokimia. Pewarnaan jaringan dilakukan dengan antibody Bax.
- Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah: mikrotom, waterbath, hot plate, freezer, incubator, staining jar, rak object glass, pipet
mikro, kertas saring, tabung sentrifuge 15ml, coated object glass, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya, Bondmaxfull automatic.
- Pulasan imunohistokimia menggunakan alat Bondmax full automatic. Antibodi primer yang digunakan adalah monoclonal antibody BAX Leica,
dengan pengenceran 1: 100.
3.8.2. Cara kerja
1. Setelah mendapat persetujuan dari komisi etik untuk melakukan penelitian, penelitian dimulai dengan mengumpulkan jaringan plasenta
pasien yang didiagnosa kehamilan preeklampsia berateklampsia dan kehamilan normotensi yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
Peneliti akan mengisi data pribadi pasien dan melakukan pengambilan sampel dari pasien yang telah melahirkan di rumah sakit tempat penelitian
Universitas Sumatera Utara
32
berlangsung baik partus pervaginam maupun seksio sesarea dan telah menyetujui serta mengisis informed consent.
2. Jaringan plasenta diambil dari bagian central plasenta bad dengan ukuran 2X1X1 cm dan difiksasi dalam pot berisi formalin 10 dengan
buffer minimal dibawah 1 jam. Setelah jumlah subjek penelitian mencapai jumlah yang diinginkan, maka pencarian subjek dihentikan.
3.Jaringan kemudian dikirim ke laboratorium patologi anatomi RSUP H Adam Malik Medan untuk selanjutnya dilakukanpembuatan blok parafin.
4. Dilakukan pewarnaan immunohistokimia. Prosedur imunohistokimia di laboratorium patologi anatomi RS Haji Adam Malik meliputi :
Slide jaringan yang telah ditempelkan pada kaca objekyang dilapisi dengan aminopropyltriethoxysilane dikeringkandi udara
kemudian dilakukan parafinisasi dengan alkoholdan xylol Slide dicuci dengan air mengalir dan dilakukanblok dengan
methanol mengandung H2O2 0,5 selama 30menit, dan dicuci kembali dengan air mengalir.
Kemudiansediaan dimasukkan dalam cairan retrieval antigen trisodium sitrat buffer 0,1 M pada microwave dengan power
levelrendah selama 30 menit dan kemudian didinginkan. selanjutnya dicuci dengan Phosfat buffer saline PBS, pH7,4
Setelah itu diberikan serum kuda normal 3 normalhorse serum selama 20 menit pada suhu ruangan.
Universitas Sumatera Utara
33
Selanjutnyasediaan diinkubasi dengan monoclonal antibody BAXdengan konsentrasi 0,2 mgpada suhu 4
o
C selama satu malam.
Untuk melihat spesifikantibodi primer yang digunakan dilakukan uji immunoblotting
Hariberikutnya sediaan dicuci dengan PBS dan diinkubasi denganantibodi sekunder kelinci anti tikus selama 30 menit
danselanjutnya dibilas kembali dengan PBS. Biotinylated horseradishperoksidase sterp-tovidin Novocastra Lab,
Univ. OfNewcastle, UK ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menitlalu dicuci kembali.
Ditambahkan chromogen DAB SigmaGermany, lalu dicuci dengan air dan diwarnai denganhematoksilin sebagai warna pembanding
dan slide ditutupdengan entelan. 5.Dilakukan interpretasi sediaan tersebut oleh dua orang ahli Patologi
Anatomi, nilai koefisien korelasi akan dihitung uji Kappa. Penilaian imunohistokimia untuk ekspresi protein BAX menggunakan
metode skoring Quantitatif imunohistokimia karena sistem ini telah biasa dilakukan di Departemen Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan.
Skor ini terdiri dari skor persentase dari sel yang terwarnaiproportion score PS dan skor intensitas pewarnaanya Intensity score IS.
6.Hasil interprestasi sediaan tersebut dilakukan analisa statistik.
Universitas Sumatera Utara
34
Tabel 3.1 Metode Skoring Quantitatif Imunohistokimia
51
Universitas Sumatera Utara
35
3.9. Kerangka kerja
