Alat – Alat Bagan Skrining Fitokimia Bagan Penelitian

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Alat – Alat

1. Gelas ukur 50 mL100 mL Pyrex 2. Gelas Beaker 250 mL1000 mL Pyrex 3. Gelas Erlenmeyer 250 mL Pyrex 4. Corong kaca 5. Corong pisah 500 mL Pyrex 6. Ekstraktor 10 L Schott Duran 7. Kolom kromatografi Pyrex 8. Tabung reaksi Pyrex 9. Plat tetes 10. Rotarievaporator Büchi R-114 11. Labu takar 500mL Pyrex 12. Labu alas 1 L Schott Duran 13. Labu rotarievaporator 1 L 14. Statif dan klem 15. Lampu UV 254 nm 356 nm UVGL 58 16. Batang pengaduk 17. Neraca analitis Mettler AE 200 18. Pipet tetes 19. Penangas air Büchi B-480 20. Penjepit tabung 21. Botol vial Universitas sumatera utara 22. Pipa kapiler 23. Alat destilasi 24. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 25. Bunsen 26. Melting Point Apparatus 27. Spektrofotometer UV-Visible 28. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 29. Spektrometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR-500MHz

3.2 Bahan-Bahan

1. Daun tumbuhan Galingging A. lebbek BENTH

2. Metanol Teknis 3. N-heksana Teknis 4. Etilasetat Teknis 5. Aquadest 6. Silika gel 40 G 70-230 mesh ASTM E.Merck.KGaA 7. FeCl 3 5 8. NaOH 10 9. Mg-HCl 10. H 2 SO 4p 11. Pereaksi Benedict 12. HCl 6 13. Kapas 14. Aluminiun Foil 7,6m x 300 mm Total Wrap 15. Plat KLT MerchKieselgel 60 F 254 Universitas sumatera utara

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Galingging A. lebbek BENTH yang diperoleh dari daerah Pascasarjana USU, Medan. Daun tumbuhan Galingging dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan Galingging sebanyak 1400 g.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Galingging

Serbuk daun tumbuhan galingging diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia 2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan Galingging, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut: - Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan Galingging A. Lebbek BENTH yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 mL - Didiamkan - Disaring - Dibagi metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi: a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d. Tabung IV : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan Universitas sumatera utara

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etilasetat. Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana : etilasetat 90:10 v v ke dalam bejana kromatografi kemudian dijenuhkan. Lalu ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etilasetat dengan perbandingan 80:20; 70:30; dan 60:40 v v . Dari hasil KLT menunjukkan bahwa di dalam daun tumbuhan Galingging terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n- heksana : etilasetat 60:40 v v

3.3.3 Ekstraksi dan Fraksinasi dari Daun Tumbuhan Galingging A. lebbek BENTH

Serbuk daun tumbuhan Galingging ditimbang sebanyak 1400 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam, dibiarkan selama ± 48 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etilasetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etilasetat menguap. Lalu fraksi etilasetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana hingga lapisan n-heksana bening. Lapisan Universitas sumatera utara metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator, kemudian diuji kandungan gula dengan pereaksi Benedict lalu dihidrolisa dengan HCl 6 sambil dipanaskan ±45 menit, didinginkan dan disaring, lalu diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali, diuapkan hingga diperoleh ekstrak pekat lapisan kloroform sebanyak 550 mg.

3.3.4 Pemisahan Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu campuran pelarut n-heksana : etilasetat. Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 60 g silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 550 mg ekstrak pekat kloroform daun tumbuhan Galingging kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etilasetat 90:10 v v ; 80:20 v v ; 70:30 v v dan 60:40 v v . Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 mL, lalu di KLT dan digabungkan fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.

3.3.5 Pemurnian dengan Rekristalisasi

Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi dimurnikan dengan cara, kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etilasetat diaduk hingga kristal terlarut sempurna. Kemudian ditambahkan n-heksan secara perlahan-lahan hingga terjadi pengendapan zat- zat pengotor didasar vial. Kemudian didekantasi larutan bagian atas, lalu diuapkan sisa pelarut hingga diperoleh kristal yang bebas dari pelarut. Universitas sumatera utara

3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi

3.3.6.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : etilasetat 60:40 v v dan sistem pelarut yang berbeda klorofom : metanol dan kloroform : etilasetat. Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak n-heksan : etilasetat 60:40 v v ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan dengan kertas saring. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etilasetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5. Kemudian diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut klorofom : metanol 70:30 v v dan kloroform : etilasetat 70:30 v v. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa kristal yang diperoleh telah murni Lampiran E.

3.3.6.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah dimurnikan dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.

3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

Identifikasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan alat Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer FT-IR, dan Spektrometer 1 H-NMR dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang. Universitas sumatera utara

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

diekstraksi maserasi dengan metanol disaring dipekatkan dibagi ke dalam 4 tabung reaksi ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan pereaksi FeCl 3 pereaksi NaOH pereaksi Mg-HCl pereaksi 5 10 H 2 SO 4p diamati peruba- diamati peruba- diamati peruba- diamati peru- han warna han warna han warna bahan warna Larutan biru violet Larutan merah muda Larutan orange kekuningan Larutan hitam 10 g serbuk daun tumbuhan Galingging Albizzia lebbek BENTH Tabung I Tabung II Tabung III Tabung IV Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Universitas sumatera utara

3.5 Bagan Penelitian

1400 gram serbuk daun tumbuhan Galingging Albizzia lebbek BENTH diskrining fitokimia dimaserasi dengan metanol sebanyak 10 L didiamkan selama ± 48 jam diulangi sebanyak 2 kali disaring ekstrak metanol residu diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan sampai pelarut metanol habis menguap ekstrak pekat metanol dilarutkan dengan etil asetat secara berulang-ulang sampai bening disaring ekstrak etil asetat diuapkan hingga seluruh etil asetat menguap dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana hingga bening residu lapisan metanol lapisan n-heksana dipekatkan dengan rotarievaporator dihidrolisa dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 45 menit didinginkan dan disaring lapisan metanol asam diekstraksi partisi dengan kloroform hingga lapisan kloroform bening dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict + residu lapisan kloroform diskrining fitokimia ekstrak pekat kloroform Hasil negatif diuapkan hingga seluruh metanol menguap diuapkan sampai pekat diskrining Universitas sumatera utara ekstrak pekat kloroform diuji KLT untuk mengetahui sistem eluen yang sesuai pada kromatografi kolom dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel 60 G 0,063-0,200 mm dan fase gerak n-heksana: etilasetat dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 vv ditampung tiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial diuji KLT untuk mengetahui harga Rf digabung fraksi dengan harga Rf yang sama fraksi30-59 fraksi 60-77 fraksi 90-110 fraksi 111-127 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 diuji FeCl 3 5 Hasil positif Hasil positif Hasil positif Hasil positif senyawa murni diuapkan dianalisa KLT dianalisis dengan spektrofotometer UV-Visible, spektrofotometer FT-IR dan spektrometer 1 H-NMR Hasil Analisa direkristalisasi Universitas sumatera utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian