metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator, kemudian diuji kandungan gula dengan pereaksi Benedict lalu
dihidrolisa dengan HCl 6 sambil dipanaskan ±45 menit, didinginkan dan disaring, lalu diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali, diuapkan hingga diperoleh ekstrak
pekat lapisan kloroform sebanyak 550 mg.
3.3.4 Pemisahan Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230
mesh ASTM dan fasa gerak yaitu campuran pelarut n-heksana : etilasetat.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 60 g silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom
kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 550 mg ekstrak pekat kloroform daun tumbuhan
Galingging kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etilasetat 90:10
v v
; 80:20
v v
; 70:30
v v
dan 60:40
v v
. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 mL, lalu di KLT dan digabungkan fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.5 Pemurnian dengan Rekristalisasi
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi dimurnikan dengan cara, kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etilasetat diaduk hingga kristal terlarut sempurna.
Kemudian ditambahkan n-heksan secara perlahan-lahan hingga terjadi pengendapan zat- zat pengotor didasar vial. Kemudian didekantasi larutan bagian atas, lalu diuapkan sisa
pelarut hingga diperoleh kristal yang bebas dari pelarut.
Universitas sumatera utara
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
3.3.6.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etilasetat 60:40
v v
dan sistem pelarut yang berbeda klorofom : metanol dan kloroform : etilasetat.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak n-heksan : etilasetat 60:40
v v
ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan dengan kertas saring. Ditotolkan kristal yang
sebelumnya dilarutkan dengan etilasetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes
sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5. Kemudian diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan
pelarut klorofom : metanol 70:30
v v
dan kloroform : etilasetat 70:30
v v.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa kristal yang diperoleh telah murni Lampiran E.
3.3.6.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah dimurnikan dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
Identifikasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan alat Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer FT-IR, dan Spektrometer
1
H-NMR dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
Universitas sumatera utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
