33
E. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap RAL tiga faktorial. Faktor pertama adalah variasi
jenis bahan kain, faktor ke dua adalah variasi bakteri uji dan faktor ke tiga adalah variasi perlakuan pada bahan tekstil.
F. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol ukur merk Pyrex, Erlenmeyer 500 mL merk Pyrex, Erlenmeyer 250 mL merk Pyrex, lampu
Bunsen, keranjang, hot plate, magnetic stirer, laminar air flow LAF, rak tabung reaksi, tabung reaksi merk Pyrex, Shaker, autoklaf merk Omron,
sentrifugasi merk H-103 N Kokusan, tabung appendorf merk falcon dan iwaki, gelas beker 1000 mL merk Pyrex, gelas beker 500 mL merk pyrex, oven merk
Uchida, tabung reaksi, tabung falkon merk Iwaki, cawan petri merk Pyrex dan Iwaki, labu ukur merk Pyrex, paper disk, jarum ose bulat, jarum ose runcing,
spektrofotometer merk Spectronic 20 Genesys, tip mikropipet 1 mL, tip mikropipet 5 mL, tip mikropipet 10 mL, mikropipet 1 mL, mikropipet 5 mL,
mikropipet 10 mL, jangka sorong ketelitian 0,001 mm, timbangan analitik merk DAN HR-250 A, inkubator merk Eyela SL-1600N.
Bahan yag digunakan dalam penelitian ini adalah kain katun, kain nilon, kain poliester, kain spandek, tisu, kapas, kertas payung, karet gelang,
alumunium foil, kloramfenikol, media Nutrient Agar NA merk Oxoid, media Nutrient Broth NB merk Oxoid, akuades steril, AgNO
3,
Staphylococcus
34 aureus
ATCC 25924, Escherichia coli ATCC 35218, dan Corynebacterium glutamicum
FHCC-0062. G.
Prosedur Penelitian
1. Sterilisasi alat Sterilisasi alat yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan secara
berbeda-beda. Alat-alat yang terbuat dari kaca, seperti tabung reaksi pyrex, cawan petri pyrex, Erlenmeyer pyrex, beaker glass pyrex dibungkus dengan
kertas payung kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC tekanan 1 atm selama 15 menit. Tip mikropipet dimasukkan ke dalam beker glass pyrex
dan dibungkus dengan kertas payung kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC tekanan 1 atm selama 15 menit. Sterilisasi jarum ose kolong,
ose jarum, cukup dipanaskan dengan api Bunsen. 2. Preparasi media
Media yang digunakan adalah Nutrient Agar NA dengan komposisi per liternya adalah powder NA 1 gr, yeast extract 2 gr, pepton 5 gr, natrium klorida
5 gr, agar 15 gr, dan media Nutrient Broth NB dengan komposisi per liternya adalah powder NB 1 gr, yeast extract 2 gr, pepton 5 gr, natrium klorida 5 gr.
Bahan dilarutkan dalam akuades kemudian dididihkan di atas hot plate. Setelah media mengalami proses pelarutan, kemudian disterilkan dengan autoklaf pada
suhu 121 ºC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit Alfred Brown dan Heidi Smith, 2015: 139
35 3. Reisolasi Corynebacterium glutamicum FHCC-0062
Perbanyakan Corynebacterium glutamicum FHCC-0062 dilakukan pada media Nutrient Agar NA miring yang dilakukan di laminar air flow LAF.
4. Preparasi Nanopartikel perak oleh Corynebacterium glutamicum FHCC- 0062
Langkah awal yang dilakukan dalam tahap preparasi ini pembuatan starter Corynebacterium glutamicum
FHCC-0062. C. glutamicum FHCC-0062 diinokulasikan dengan jarum ose kolong sebanyak 3 full loop pada 100 mL
Nutrient Broth NB secara aseptik, selanjutnya digojok menggunakan shaker
selama 24 jam pada suhu ruangan dengan kecepatan 121 rpm. Selanjutnya starter dilihat nilai OD Optical Density apakah sudah bernilai 1 atau belum
dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 645 nm Nam, 2011: 21. Penggunaan OD sebagai satuan hitung ini disebabkan karena
dalam mikrobiologi, OD sebanding dengan kepekatan sel dalam suspensi biakan bakteri. Nilai OD 1 bermakna dalam 1 mL biakan terdapat 1x10
8
bakteri Sylvia, T. Pratiwi, 2008: 101. Setelah itu melakukan perbanyakan Corynebacterium glutamicum
FHCC-0062 pada media Nutrient Broth NB dengan perbandingan 1:10, dimana dalam 250 mL NB diberi 25 mL starter,
yang kemudian digojok menggunakan shaker selama 240 jam dengan kecepatan 121 rpm pada suhu ruangan. Selanjutnya dilakukan pemanenan
bakteri dengan cara mensentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama 35 menit. Filtrat Corynebacterium glutamicum FHCC-0062 yang telah diperoleh
kemudian didiamkan selama 24 jam, dan selanjutnya dibilas menggunakan
36 akuades steril dengan cara disentrifus selama 15 menit pada kecepatan 2500
rpm, dimana pembilasan dilakukan sebanyak 2 kali Sneha, 2010: 990. Filtrat Corynebacterium glutamicum FHCC-0062 hasil sentrifus
ditambahkan A
g
NO
3
0,006 M yang digojok menggunakan shaker pada suhu
ruangan selama 6 jam dengan kecepatan 121 rpm dalam kondisi tanpa cahaya. Kondisi tanpa cahaya dimaksudkan supaya dalam proses reduksi Ag
+
menjadi Ag
tidak terjadi pemutusan ikatan, radikal bebas, maupun aglomerasi oleh cahaya Sneha, 2010: 990. Setelah itu keberadaan produk berupa nanopartikel
perak dikarakterisasi menggunakan UV-Vis spectrophotometer. 5. Pelapisan Nanopartikel Perak pada Bahan Tekstil
Bahan tekstil berupa katun, nilon, poliester, dan spandek dipotong dengan ukuran 6 mm x 6 mm dengan menggunakan paper disk. Bahan tekstil yang
telah dipotong disterilkan dengan cara dicuci, dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 70 °C, dan kemudian UV pada LAF selama 15 menit. Sampel
bahan tekstil yang sudah steril dimasukkan dalam koloid nanopartikel perak dalam Erlenmeyer, kemudian dishaker pada kecepatan 121 rpm selama 24 jam
dan dikeringkan dengan oven pada suhu 70 C Duran et al., 2007: 206.
6. Uji Antibakteri pada Bahan Tekstil
Sifat antibakteri pada bahan tekstil dilapisi nanopartikel perak diuji dengan bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25924 dan
Escherichia coli ATCC
35218 dengan kontrol negatif berupa kain tanpa dilapisi apapun, serta kontrol positif berupa kain yang dilapisi kloramfenikol.
37 Tahapan awal dalam uji antibakteri adalah penyiapan suspensi bakteri uji.
Isolat murni Staphylococcus aureus ATCC 25924 dan Escherichia coli
ATCC 35218 ditanam dalam media Nutrient broth NB menggunakan ose kolong
secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 30
o
C, selama 24 jam dan diukur OD-nya Nam, 2011: 21.
Tahap kedua yaitu penanaman bakteri uji. Hasil suspensi bakteri uji sebanyak 0,1 mL dituangkan pada permukaan medium Nutrient Agar NA
dengan pipet secara aseptik dan diratakan dengan drygalsky steril. Sampel uji diletakkan pada permukaan media yang sudah ditanami bakteri uji,
diinkubasikan pada suhu ruang Michael et al., 2009: 785. Tahap terakhir dalam uji aktivitas antibakteri pada bahan tekstil yang
dilapisi nanopartikel perak adalah pengamatan dan pengukuran zona. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode in vitro jenis Kirby
Bauer yang terlihat pada Gambar 15. Pengamatan dilakukan setiap 6 jam sekali
selama 48 jam inkubasi. Pengukuran zona hambat dilakukan pada bahan tekstil yang dilapisi nanopartikel perak, tanpa dilapisi apapun, dan yang dilapisi
kloramfenikol. Pengukuran diameter zona hambat dilakukan dengan mengukur jarak dari tepi sampel uji ke batas lingkaran zona hambat menggunakan jangka
sorong ketelitian 0,02 mm pada 3 sisi sampel uji Michael et al., 2009: 786. Kemudian data yang diperoleh dirata-rata. Sifat antibakteri diketahui dengan
melihat zona hambatnya dan kemudian mengukur diameter zona hambatnya dan dibandingkan dengan kontrol negatif maupun positif.
38 Gambar 15. Metode Kirby Bauer Lay, 2004: 632.
Uji antibakteri dalam penelitian ini menggunakan dua kontrol, yaitu kontrol negatif dan kontrol positif. Kontrol negatif berupa bahan tekstil tidak
dilapisi, sedangkan kontrol positif berupa bahan tekstil dilapisi kloramfenikol. Penggunaan kloramfenikol dalam kontrol positif karena kloramfenikol
mempunyai spektrum antibakteri yang luas seperti nanopartikel perak Pawit
Indriyana, 2014: 64 H.
Teknik analisis data
Data kemampuan Corynebacterium glutamicum FHCC-0062 dalam mensintesis larutan perak nitrat menjadi nanopartikel perak dianalisis secara
deskriptif. Data kemampuan antibakteri bahan tekstil yang dilapisi nanopartikel perak pada Staphylococcus aureus ATCC 25924 dan
Escherichia coli
ATCC 35218 dianalisis menggunakan One Way Analysis of Variance ANOVA dengan Uji lanjut LSD Least Significance Different dengan taraf
5 pada SPSS versi 20.
39
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori