Total Hemosit Blaxhall dan Daishley, 1973 Diferensial Hemosit Martin dan Graves , 1995 Aktifitas Fagositosis Anderson dan Siwicki , 1993

12 kering. Pengujian dilakukan dengan meletakkan kertas cakram berdiameter 6 mm yang telah dicelupkan pada larutan Trichoderma sp. dengan konsentrasi 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 ppm diatas agar cawan yang telah disebari V. harveyi. Biakan bakteri V. harveyi kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Respon antibakterial ditentukan dengan mengukur zona bebas bakteri disekeliling kertas cakram yang kelihatan bening dan diukur diameter daerah hambatnya Lay, 1994. Uji In Vivo Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan dengan masing masing 3 kali ulangan, sebagai berikut : 1. Kontrol positif : udang uji diinjeksi V. harveyi 10 6 CFUekor. 2. Kontrol negatif : udang uji diinjeksi larutan fisiologis NaCl 0,85. 3. Perlakuan pengobatan : udang uji diinjeksi dengan V. harveyi 10 6 CFUekor, kemudian diinjeksi Trichoderma sp. sebanyak 0,1 mlekor dengan dosis 1200 ppm 11,3 mgekor sehari kemudian. 4. Perlakuan pencegahan : udang uji diinjeksi dengan Trichoderma sp. sebanyak 600 ppm 5,6 mgekor kemudian diinjeksi dengan V. harveyi 10 6 CFUekor sehari kemudian. Pengamatan parameter sistem imun dilakukan 24, 48, 72, 96, jam pasca infeksi. Pemeriksaan Parameter Penelitian 1. Sistem Imun Parameter imun yang diukur adalah total hemosit, diferensial hemosit, aktifitas fagositosis, dan aktifitas phenoloksidase.

a. Total Hemosit Blaxhall dan Daishley, 1973

Hemolim diambil sebanyak 0,1 ml dibagian pangkal kaki jalan ke 5 dengan syringe 1 ml yang sudah berisi antikoagulan sebanyak 0,3 ml, kemudian dihomogenkan selama 5 menit. Tetesan pertama hemolim pada syringe dibuang, selanjutnya hemolim diteteskan ke haemositometer dan dihitung jumlah selnya 13 per ml dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40 kali. Total hemosit dihitung dengan menggunakan rumus : Total Hemosit selml = Rata-rata sel terhitung x 25 x FP x 10.000 Keterangan : FP = faktor pengenceran

b. Diferensial Hemosit Martin dan Graves , 1995

Hemolim yang telah diambil dari udang uji diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, kemudian dikeringkan di udara dan difiksasi dengan metanol 100 selama 5 menit. Setelah itu dikeringkan udara kembali dan diwarnai dengan larutan giemsa 10 selama 10 menit, dicuci dalam air mengalir selama 30 detik dan dibiarkan kering. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 100 kali dan dibedakan menurut jenisnya yaitu sel hialin, semi granular dan granular. Persentase jenis hemosit dihitung dengan menggunakan rumus : 100 x hemosit sel total hemosit sel jenis tiap jumlah hemosit sel Jenis 

c. Aktifitas Fagositosis Anderson dan Siwicki , 1993

Hemolim 0,1 ml dimasukkan kedalam mikroplate dan dicampur secara merata dengan 25 μl bakteri Staphylococcus aureus dan diinkubasi selama 20 menit. Hemolim sebanyak 5 μl diteteskan pada objek glas dan dibuat preparat ulas lalu dikeringkan. Fiksasi dengan metanol 100 selama 5 menit dan diwarnai dengan giemsa selama 15 menit. Aktivitas fagositik diukur berdasarkan persentase sel-sel fagosit yang melakukan fagositosis. Aktifitas fagositosis dihitung dengan menggunakan rumus : 100 x fagosit sel jumlah s fagositosi melakukan yang fagosit sel jumlah s fagositosi Aktifitas  14

d. Aktifitas Phenoloxidase PO Liu and Chen, 2004