9
2.3.6 Aktivitas Phenoloxydase PO
Pengukuran PO dilakukan berdasarkan prosedur yang dikemukan oleh Liu dan Chen 2004. Aktivitas PO hemosit diukur berdasarkan formasi dopachrome
yang dihasilkan oleh L-DOPA. Sebanyak 1 ml campuran hemolymph- antikoagulan disentrifuse pada kecepatan 1.500 rpm selama 10 menit pada
temperatur 4
o
C. Supernatan dikeluarkan dan pelet disuspensikan kembali secara perlahan-lahan ke dalam 1 ml larutan cacodylate-citrate buffer 0,01 M sodium
cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, pH 7 kemudian disentrifuse kembali. Pelet kemudian diambil dan disuspensikan dalam 200 µ l
cacodylate-citrate buffer 0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, pH 7.
Suspensi sel sebanyak 100 µ l kemudian diinkubasi dengan 50 µ l trypsin 1 mgml cacodylate buffer sebagai aktivator selama 10 menit pada temperatur 25-
26
o
C. Selanjutnya ditambahkan 50 µl L-DOPA 3 mgml cacodylate buffer setelah 5 menit, dan ditambahkan 800 µ l cacodylate buffer. Densitas optikal OD
diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm.
Larutan standar mengandung 100 µ l suspensi haemocyte, 50 µ l cacodylate buffer pengganti tripsin, dan 50 µ l L-DOPA digunakan untuk mengukur
background aktivitas PO pada semua larutan uji. Densitas optikal OD dari aktivitas PO pada semua kondisi uji dinyatakan sebagai formasi dopachrome
dalam 50 µ l haemolymph.
2.3.7 Diferensial Hemosit
Diferensial hemosit dihitung berdasarkan metode yang dilakukan Martin dan Graves 1995. Hemolim diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan,
kemudian dikeringudarakan. Preparat difiksasi dengan metanol selama 5-10 menit kemudian dikeringudarakan kembali. Preparat direndam dalam larutan giemsa
selama 15-20 menit, dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering. Ulasan hemolim diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali dan
diidentifikasi selnya. Jumlah hemosit dihitung hingga 100 sel dan ditentukan persentase tiap jenisnya.
10
2.4 Kualitas Air
Kategori