4
sebanyak 8 gram dan media LIA sebanyak 8,25 gram masing-masing dilarutkan dalam 250 ml akuades. Media dilarutkan dan disterilisasi menggunakan sterilisasi uap basah 121
C selama 20 menit. Media disimpan di dalam kulkas sebagai stok media.
5. Pembuatan Stok Bakteri
Klebsiella pneumoniae dan Streptococcus pyogenes diambil sebanyak satu mata ose digoreskan secara streak plate pada media Mueller Hinton. Kultur diinkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam. Setelah bakteri tumbuh, disimpan pada suhu 4
C.
6. Pembuatan Suspensi Bakteri
Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan cara sebanyak 3-5 koloni bakteri diambil dari stok bakteri 24 jam, disuspensikan ke dalam media BHI steril dan diinkubasi selama 2-6
jam dengan suhu 37
o
C. Mc. Farland 1.5x10
8
CFUmL digunakan sebagai standar untuk menentukan kekeruhan suspensi bakteri. Suspensi yang lebih keruh ditambah dengan larutan
salin untuk uji dengan metode difusi disk.
7. Pengecatan Gram
Suspensi bakteri diambil 1 mata ose, digoreskan pada obyek gelas yang telah dibebaslemakkan. Goresan bakteri ditetesi formalin 1 dan dibiarkan 5 menit, dikeringkan
lagi, dan preparat siap digunakan. Preparat yang sudah siap dicat digenangi cat gram A selama 1-3 menit, kemudian digenangi cat gram B selama 0,5-1 menit, setelah itu cat dibuang
dan dicuci menggunakan air. Selanjutnya preparat ditetesi dengan gram C sampai warna cat luntur, kemudian preparat digenangi gram D 1-2 menit, dicuci dan dikeringkan pada suhu
kamar. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x.
8. Uji Biokimiawi
Uji biokimiawi bakteri Klebsiella pneumoniae dilakukan dengan cara diambil satu mata ose digoreskan dalam media KIA, LIA, dan MIO. Ketiga media yang telah ditanami tersebut
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam. Uji biokimiawi bakteri Streptococcus pyogenes dilakukan dengan cara uji katalase dengan meletakkan bakteri pada kaca objek dan diteteskan
H
2
O
2
3 di atas kaca objek sebanyak satu tetes dan langsung diamati terjadinya pengurangan hidroksi peroksida. Uji katalase dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri memecah
H
2
O
2
. Analisis hasil dilakukan berdasarkan karakteristik kedua bakteri tersebut.
9. Pembuatan Seri Konsentrasi
Seri konsentrasi ekstrak etanol kulit buah durian masing-masing dibuat 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Konsentrasi 25 dibuat dengan cara ekstrak etanol kulit buah durian
diambil sebanyak 250 mg dan larutkan dengan DMSO sampai 1 mL. Konsentrasi 12,5 dibuat dengan cara diambil 500 µl dari konsentrasi 25 kemudian dilarutkan dengan DMSO
5
sampai 1 mL. Untuk konsentrasi 6,25 dibuat dengan cara diambil 500 µl dari konsentrasi 12,5 dan dilarutkan dengan 1 mL DMSO. Konsentrasi 3,125 dibuat dengan cara diambil
500 µL dari konsentrasi 6,25 kemudian dilarutkan dengan 1 mL DMSO. Masing-masing
seri konsentrasi diambil 10 µL dan diteteskan pada disk dan dibiarkan sampai mengering. 10.
Uji Aktivitas Antibakteri
Sebanyak 20 mL media MH dimasukkan dalam cawan petri yang steril, didiamkan 30 menit ditunggu sampai mengeras. Sebanyak 200 µL suspensi bakteri diambil, dimasukkan
dalam media MH, diratakan dengan spreader glass steril pada permukaan MH, didiamkan 3- 5 menit sebelum penanaman disk. Media diinkubasi pada suhu 37
C selama 18-24 jam di dalam inkubator. Diameter zona hambat masing-masing konsentrasi dihitung dan
dibandingkan terhadap kontrol. Kontrol positif yang digunakan adalah streptomisin untuk Klebsiella pneumoniae sedangkan untuk Streptococcus pyogenes adalah tetrasiklin. Kontrol
negatif yang digunakan adalah DMSO 100. Aktivitas antimikroba dapat ditentukan dengan
mengukur diameter zona hambat yang dinyatakan dalam satuan mm. 11.
Uji Kromatografi Lapis Tipis
Uji kromatografi lapis tipis dilakukan dengan menggunakan fase diam silica gel GF
254
yang telah diaktifkan dengan cara dipanaskan pada suhu 105 -110
C selama 1 jam. Konsentrasi ekstrak yang digunakan sebesar 10, sebanyak 6 µL larutan ditotolkan pada fase
diam, ditunggu sampai kering, kemudian akan dielusi dengan fase gerak. Plat diangkat dan dikeringkan hingga pelarut menguap. Penampakan bercak dilihat dibawah sinar tampak, UV
254 dan 366 nm. Deteksi flavonoid dilakukan dengan reagen sitroborat. Bercak terlihat semakin tinggi intensitas warnanya di bawah UV 366 nm. Deteksi saponin dilakukan dengan
reagen Liebermann-Burchard dan diamati bercak dibawah sinar tampak UV 366 nm. Bercak yang muncul berwarna biru, hijau, merah muda, oranye. Deteksi minyak atsiri dilakukan
dengan pereaksi semprot anisaldehid-H
2
SO
4
kemudian dipanaskan pada suhu 110 C selama
10 menit dan bercak yang muncul berwarna biru, hijau, merah dan coklat pada UV 366 nm. Bercak yang muncul kemudian dianalisis dengan menentukan nilai Rf untuk masing-masing
uji.
12. Uji Tabung
