PCR Alele’s Specific Amplification PASA Analisis hasil PASA

17

4.8. PCR Alele’s Specific Amplification PASA

Metode PASA pada penelitian ini menggunakan tiga primer, yaitu; primer universal D1 5’-AAC GTT GGG GCC TTT GCG TA-3’ nt 3423-3404 , primer normal DN 5’-GGG TTT GTT AAG ATG GCA GA-3’ nt 3224-3243 , dan primer mutan DM 5’- GGG TTT GTT AAG ATG GCA TG-3’ nt 3224-3243 . PASA dilakukan dengan teknik PCR pada dua tabung. Tabung pertama menggunakan primer universal D1 dan primer normal DN sedangkan tabung kedua menggunakan primer universal D1 1 μL dan primer mutan DMt masing-masing 1 μL, 20 pmolμL. Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA polimerase 0,5 μL, buffer taq 5 μL, dNTP dATP, dCTP, dTTP, dGTP 1 μL, MgCl2 7,5 μL, ddH2O steril 24 μL, dan templat mtDNA. Proses PCR dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler EppendorfTM sebanyak 30 siklus. Tahap awal proses PCR adalah tahap denaturasi awal yang akan dilakukan pada suhu 94°C selama 5 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu tahap denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, tahap penempelan primer annealing pada suhu 57°C selama 30 detik, dan tahap perpanjangan primer extension pada suhu 72°C selama 50 detik. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan proses extension pada suhu 72°C selama 10 menit. nt3224 nt3243 nt3423 Gambar 5. Primer yang digunakan pada PASA. D1, primer reverse universal; DN, primer forward alela normal; DM, primer forward mismatch DNA mutan. D1 DN DM 200 bp mtDNA 18

4.9. Analisis hasil PASA

Gambar 6. Analisis Hasil PASA Metode PASA dianggap sebagai salah satu metode yang sangat sederhana yang bekerja berdasarkan prinsip mismatch basa ujung 3’ primer yang menempel pada posisi mutasi yaitu A3243G. Secara teoretis, apabila ujung 3’ primer tidak komplementer dengan basa G di posisi 3243, maka tidak akan terjadi perpanjangan, begitu pula sebaliknya. Karakterisasi fragmen yang terbentuk pada PASA dengan menggunakan 2 tabung ini, akan menghasilkan perbedaan antara alel normal, mutasi homoplasmi, dan mutasi heteroplasmi seperti digambarkan pada Gambar 6. Apabila sampel mengandung mutasi heteroplasmi A Æ G pada titik 3243, maka baik tabung 1 yang mengandung primer D1Dn maupun tabung 2 yang mengandung primer D1Dmt akan menghasilkan produk PCR dengan pita berukuran 200 pb, ini dikarenakan mutasi yang bersifat heteroplasmi memiliki campuran templat mtDNA mutan dan templat normal. Sampel yang mengandung Alel normal hanya menghasilkan produk PCR pada tabung 1, sedangkan pada mutasi homoplasmi hanya positif pada tabung 2. Tabung 1 2 + + Heteroplasmi Tabung 1 2 - + Homoplasmi Tabung 1 2 + - Normal Tabung 1 • Template DNA • Reagen PCR • Primer D1 • Primer DN Tabung 2 • Template DNA • Reagen PCR • Primer D1 • Primer DMt 19

4.10. Alur Penelitian