Alur Penelitian Sel Uji Bahan Kimia yang Digunakan Pembuatan Larutan MTT 3 Pembuatan Larutan Trypsin

21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Daun tumbuhan paku Angiopteris angustifolia C. Presl.

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Alur Penelitian

Simplisia Maserasi dengan etanol 70 Ekstrak etanol dipekatkan dengan evaporator Ekstrak etanol kental Uji sitotoksisitas dengan metode MTT Perhitungan penghambatan proliferasi Analisa data lC 50 Sel MCF-7 Thawing Subkultivasi Perhitungan kepadatan sel dengan Haemocytometer Analisa kandungan kimia : Alkaloid, Flavonoid, glikosida, saponin, tanin, dll. Ekstrak dipekatkan dengan Frezee Dry. 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

3.2.1 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan dari bulan Juni 2012 sampai bulan Desember 2012.

3.2.2 Tempat Penelitian

Pembuatan ekstrak etanol dilakukan di Laboratorium Product Natural Analysist PNA FKIK Jurusan Farmasi UIN Jakarta. Penelitian Uji Sitotoksisitas dilakukan di Laboratorium Litbang RS. Kanker Dharmais – Jakarta.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Alat Penelitian

Alat – alat yang digunakan adalah gunting, kertas koran, pisau, erlenmeyer, gelas ukur, spatula, blender, labu ukur, kertas saring, rotari evaporator, kapas, corong, cawan penguap, lemari es, vial, oven, satu set tabung reaksi, timbangan analitik Kern, inkubator CO 2 Memmert, autoklaf Hirayama, sentrifuge Hettich, sentrifuge tube 15 mL dan 50 mL Corning, Laminar Air Flow cabinet LAF, biological safety cabinet II Esco, mikroskop inverted Olympus, tangki nitrogen cair Thermo, culture flask Corning, cryogenic vials Nalgene, mikro pipet Eppendorf, pipet tips Axygen, pipet tips 5 mL Eppendorf, syiringe 200 cc Terumo, syiringe filter Minisart, vortex Heidolph, tabung conical Nunclon, microplate 96 sumuran Nunclon, haemocytometer Nebauer, microplate reader, tabung falcon, hot plate, kulkas 4 o C dan - 20 o C Toshiba, kulkas -80 o C Thermo.

3.3.2 Bahan yang digunakan a.

Simplisia Bahan utama dalam uji sitotoksisitas ini adalah bagian daun dari tumbuhan paku yaitu Angiopteris angustifolia [C.Presl] yang diperoleh dari hutan daerah bogor, dan telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Litbang LIPI Cibinong, Bogor. 23 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

b. Sel Uji

Sel yang digunakan untuk uji sitotoksik adalah sel MCF-7 yang diperoleh dari stok Laboratorium Litbang RS. Kanker Dharmais Jakarta.

c. Bahan Kimia yang Digunakan

Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah etanol 70, klorofom, aquadest, HCl, dragendorf, meyer, serbuk Mg, amil alkohol, FeCl 3 , pereaksi Stiasny Formaldehid 30 : HCl pekat = 2 : 1, Na asetat, NaOH, pereaksi Liebermann-Buchard 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat, eter, ammonia NH 4 OH 10, media sel RPMI Rosewell Park Memorial Institute Gibco, Phosphate Buffered Salina PBS, Penicillin-streptomisin, Fetal Bovine Serum FBS Sigma, Trypsin EDTA 5 Sigma, MTT [3-4,5 dimetiltiazol-2-yI-2,5 difenil tetrazolium bromide] Sigma, Trypan Blue Stain 0,4 Sigma, DMSO Dimetil Sulfoksida AppliChem, Sodium bikarbonat NaHCO 3 .

3.4 Metode Penelitian

3.4.1 Persiapan Simplisia

Daun tumbuhan paku yang telah dipisahkan dari batang dan tangkainya, kemudian dibersihkan menggunakan tissue untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada daun tumbuhan paku tersebut. Kemudian dirajang dan dikering anginkan. Setelah kering, daun tumbuhan paku diblender sehingga diperoleh simplisia halus.

3.4.2 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak etanol dilakukan dengan cara maserasi serbuk daun tumbuhan paku Angiopteris angustifolia C. Presl. menggunakan etanol 70. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dengan pelarut, penggantian pelarut dilakukan 3 hari sekali sampai cairan pelarut tidak berwarna atau bening, dimana setiap hari labu maserasi digoyang-goyangkanagar semua serbuk dapat menyentuh pelarut dengan sempurna. Setelah semua filtrat terkumpul dilakukan pemekatan dengan evaporator pada suhu 50-60 o C sampai pelarut tidak lagi menetes. Akan tetapi setelah dipekatkan ekstrak tersebut masih mengandung air, 24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kemudian dilakukan teknik freezdry untuk mengangkat air tersebut sehingga didapat ekstrak kental. Proses freezdry dilakukan selama 12 jam.

3.4.3 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa kimia seperti alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, fenol, glikosida, dan triterpenoid yang terdapat pada ekstrak.

a. Pemeriksaan Ekstrak

Ayoola et al., 2008 1 Gula Pereduksi Uji Fehling Larutan ekstrak etanol 0,5 gram ekstrak dalam 5 mL aquadest lalu ditambahkan larutan Fehling A dan B kemudian dididihkan dalam tabung reaksi. Perubahan warna yang terjadi pada larutan mengindikasikan adanya gula pereduksi. 2 Terpenoid Uji Salkowski Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 2 mL kloroform, kemudian ditambahkan 3 mL asam sulfat H 2 SO 4 untuk membentuk lapisan. Adanya warna merah kecoklatan diantara lapisan mengindikasikan adanya terpenoid. 3 Triterpenoid Tiwari, 2011 Uji Salkowskii: Ekstrak dilarutkan dengan kloroform dan disaring. Filtrat kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan asam sulfat, lalu dikocok dan didiamkan. Terbentuk warna kuning keemasan mengindikasikan adanya triterpenoid. 4 Flavonoid Terdapat 3 metode yang digunakan untuk menguji keberadaan flavonoid :  Pertama: 5 ml larutan ammonia ditambahkan ke dalam filtrat air dari ekstrak, lalu ditambahkan 1 mL asam sulfat. Terbentuk warna kuning menunjukkan adanya flavonoid.  Kedua: Beberapa tetes dari larutan ammonia 1 ditambahkan ke dalam filtrat ekstrak. Terbentuk warna kuning menunjukkan adanya flavonoid.  Ketiga: Sejumlah cuplikan ekstrak ditambahkan 10 mL etil asetat dan dipanaskan atau menggunakan penangas air selama 3 menit. Campuran 25 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta kemudian disaring, diambil 4 mL filtratnya dan ditambahkan dengan 1 mL larutan ammonia. Terbentuk warna kuning menunjukkan adanya flavonoid. 5 Saponin 0,5 gram ekstrak ditambahkan 5 mL aqua destilat dalam tabung reaksi. Larutan kemudian dikocok dengan kuat, lalu diamati busa yang terbentuk secara stabil. Ke dalam busa ditambahkan 3 tetes minyak zaitun lalu dikocok kuat, terbentuknya emulsi mengindikasikan keberadaan saponin. 6 Tannin 0,5 gram ekstrak dididihkan dalam 10 mL aquadest dalam tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan beberapa tetes ferri klorida 0,1. Terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin. 7 Alkaloid Tiwari, 2011 Ekstrak dilarutkan dalam HCl dan disaring, lalu filtratnya dikumpulkan. Uji Meyer: Filtrat ditambahkan dengan reagent Meyer potasium merkuri iodida. Terbentuk endapan berwarna kuning mengindikasikan adanya alkaloid. Uji Dragendroff: Filtrat ditambahkan dengan reagent Dragendroff larutan potasium bismut iodida. Terbentuk endapan merah mengindikasikan adanya alkaloid. 8 Glikosida Jantung Uji Keller-Killani 0,5 gram ekstrak dilarutkan dengan 5 mL aquadest dan ditambahkan 2 mL asam asetat glasial yang mengandung satu tetes larutan ferri klorida. Lalu ditambahkan pada lapisan bawah dengan asam sulfat. Terbentuknya cincin coklat diantara lapisan menujukkan adanya deoxysugar yang merupakan karakteristik dari kardeonolid. Cincin ungu dapat terlihat dibawah cincin coklat, pada lapisan asam asetat dapat terbentuk cincin kehijauan sedikit diatas cincin coklat lalu tersebar perlahan-lahan keseluruh lapisan tersebut. 9 Fenol Tiwari, 2011 Uji Ferri Klorida: Ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri klorida. Terbentuk warna hitam kebiru-biruan mengindikasikan adanya fenol 26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10 Protein Tiwari, 2011 Uji Xantoprotein: Ekstrak ditambahkan beberapa tetes dari larutan asam nitrat. Terbentuk warna kuning mengindikasikan adanya protein. b. Rendemen total ekstrak etanol tumbuhan paku Rendemen ekstrak tumbuhan paku total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk dengan berat akhir ekstrak tumbuhan paku total yang dihasilkan.

3.4.4 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang digunakan harus dalam keadaan steril. Untuk senyawa yang tidak tahan terhadap pemanasan perlakuan dapat dilakukan secara aseptis di dalam LAF Laminar Air Flow, hal ini bukanlah proses sterilisasi akan tetapi dilakukan untuk mencegah adanya kontaminasi. Filter yang umumnya digunakan adalah syiringe filter membrane non pyrogenic dengan ukuran pori 0,2 µM. Untuk alat-alat gelas dicuci bersih lalu dikeringkan, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit.

3.4.5 Pembuatan Reagen a.

Pembuatan Larutan PBS Phosphat Buffer Saline Ke dalam gelas becker dimasukkan aqua steril lalu ditambahkan serbuk PBS secara perlahan-lahan dan diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai serbuk terlarut sempurna. Dilakukan pengecekan pH 7,2. Kemudian dimasukkan ke dalam botol yang bertutup dan disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 o C. Lalu disimpan pada suhu ruangan Freshney, 2010. Adapun pembuatan secara manual adalah dengan Sebanyak 2.16 gram hidrogen fosfat Na 2 HPO 4 ditimbang, kemudian ditambahkan 0.20 gram kalium fosfat KH 2 PO 4 , 8.0 gram natrium klorida NaCl dan 0.20 gram kalium klorida KCl. Kemudian dilarutkan dalam aquadest steril hingga 1 liter. Larutan distabilkan pada pH 7.2 dengan menggunakan alat pH meter kemudian disterilkan dengan autoklaf dan disimpan pada suhu kamar. 27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

b. Pembuatan Larutan MTT 3

– [4,5 – dimethylthiazol – 2Yi] – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromide Melarutkan 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide MTT sebanyak 50 mgmL dalam PBS. Kemudian disterilisasi dengan filtrasi Freshney, 2010. Filtrasi dilakukan menggunakan syiringe filter membrane non pyrogenic dengan diameter pori sebesar 0.2 μM.

c. Pembuatan Larutan Trypsin

25 gram Trypsin ditimbang dan ditambahkan NaCl 0,14 M hingga 1 liter kemudian diaduk hingga larut menggunakan magnetic stirrer selama 1 jam pada suhu ruangan. Lalu disterilisasi dengan filtrasi. Kemudian dibagi ke dalam 10-20 ml bagian dan disimpan pada suhu -20 o C. Sebelum digunakan dilarutkan terlebih dahulu dengan PBS perbandingan 1: 10. Larutan Trypsin yang disimpan pada suhu 4 o C akan stabil maksimal 3 minggu Freshney, 2010.

d. Pembuatan Larutan Trypan Blue