29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3 Selanjutnya sel diinkubasi selama 3 menit dalam inkubator suhu 37
o
C dengan sedikit membuka tutup cultur flask.
4 Setelah 3 menit, cultur flask dikeluarkan dari inkubator kemudian diketuk-
ketuk bagian luar dari dinding cultur flask dengan tujuan agar sel terlepas dari permukaan cultur flask. Sel dilihat di mikroskop untuk memastikan
bahwa sel sudah lepas dari permukaan dinding culture flask. 5
Culture flask kemudian dipindahkan ke dalam LAF ditambahkan RPMI berserum kedalam culture flask sebanyak 400 µL untuk menonaktifkan
tripsin lalu dihomogenkan. 6
Larutan sel dimasukkan ke dalam tabung conical steril dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 1000 rpm.
7 Supernatan dibuang dan diganti dengan medium RPMI ± 1 mL, kemudian
dihomogenkan dengan pipet sehingga sel menyebar ke seluruh media. 8
Larutan sel tersebut diencerkan dengan tripan blue 10 µL tripan blue + 10 µL sel dan dihitung jumlah selnya menggunakan Haemocytometer. Syarat
jumlah sel dalam setiap sumuran adalah 5x10
3
sel. 9
Sel dihitung dari keempat bidang besar pada sudut seluruh permukaan yang terbagi. Penghitungan dimulai dari sisi kiri atas kemudian ke kanan,
turun ke bawah dan dari kanan ke kiri. Cara tersebut dilakukan pada keempat bidang besar. Sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri atau
atas harus dihitung. Sebaliknya sel yang menyinggung garis batas sebelah kanan atau bawah tidak dihitung. Jumlah sel per ml dihitung menggunakan
rumus:
n =
Jumlah sel dalam keempat bidang besar 4
= Jumlah bilik haemocytometer yang dihitung
P =
Faktor pengenceran terhadap indikator warna
3.4.8 Pemeliharaan Terhadap Kultur Sel Kanker
Sel diamati setiap hari menggunakan mikroskop untuk memeriksa kemungkinan adanya pencemaran mikroorganisme lain seperti bakteri dan
jamur. Apabila medium kultur telah berubah warna maka diganti dengan medium RPMI berserum yang baru.
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.9 Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas menggunakan plat kultur jaringan 96 sumuran sebagai media uji. Sebanyak 100 µL suspensi sel dalam medium RPMI
berserum dimasukkan kedalam setiap sumuran pada plat kultur jaringan, lalu diinkubasi dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C selama 48 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik Meiyanto, 2008. Setelah 48
jam sel akan melekat pada dasar mikroplate, lalu medium dibuang, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 200 µL larutan uji ekstrak
etanol tumbuhan paku dalam medium RPMI 1640 dan larutan kontrol DMSO kontrol negatif dalam medium RPMI 1640 dengan konsentrasi
0,1 serta kontrol sel dalam medium sebanyak 200 µL sebagai blanko. Kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Sel diamati dengan mikroskop pada saat inkubasi 4, 8, dan 24 jam.
Didalam LAF masing-masing medium di dalam sumuran dibuang. Kemudian ditambahkan 100 µL PBS lalu digoyang-goyangkan dan
dibuang. Sebanyak 100 µL RPMI berserum dan 10 µL MTT ditambahkan ke dalam setiap sumur, kemudian diinkubasi dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
o
C selama 4 jam, dikeluarkan dari inkubator dan dilihat kristal formazan ungu yang terbentuk dengan mikroskop. Selanjutnya
ditambahkan 100 µL DMSO pada masing-masing sumuran dan diaduk sampai homogen, Masing-masing sumur dibaca secara langsung setelah
penambahan DMSO menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 540-600 nm CCRC, 2008.
3.4.10 Perhitungan Persentase Kematian Sel
Dengan menggunakan metode MTT presentasi kematian sel merupakan selisih absorbansi kontrol negatif dengan absorbansi sampel uji
dibagi absorbansi kontrol negatif dikalikan 100. Masing-masing absorbansi telah dikoreksi dengan absorbansi dari larutan uji saja setiap
kadar. Perhitungan kematian sel dengan menggunakan metode MTT menggunakan rumus sebagai berikut: Zakaria, 2011
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.11 Analisa Data
