BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Oktober 2010 sampai dengan Oktober 2011 di laboratorium Mikologi dan Mikroteknik Tumbuhan Biologi FMIPA serta
Biorin PPSHB IPB.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian iniialah tubuh buah jamur pelawan yang dikoleksi dari Air Pasir Bangka Tengah pada bulan Maret, dan September
2011.
Metode Penelitian 1. Karakterisasi Morfologi
1.1. Metode Pengumpulan Bahan
Berdasarkan Largent 1973 pengambilan sampel jamur dilakukan dengan cara mencabut keseluruhan bagia-bagian badan buah tudung buah, pori, dan
tangkai dengan menggunakan sekop kecil. Spesimen jamur pelawan diambil lalu dibungkus menggunakan kertas tisyu kemudian dibungkus dengan keras merang,
dan dimasukkan ke dalam kotak berisi es kering. Cara lain yaitu tubuh buah dimasukkan ke dalam kotak koleksi yang terbuat dari plastik dan menutupnya
rapat-rapat agar tidak terjadi penguapan. Foto dilakukan untuk merekam karakter segar di lapang dan setelah sampai di laboratorium. Sampel segar diambil untuk
isolasi DNA, sedangkan sisanya dikeringkan dan disimpan pada kertas merang dan dimasukkan ke dalam lemari es. Sebagian lagi dikeringkan dengan oven pada
suhu 80°C. Akar simbion yang diamati ialah yang melekat pada dasar tangkainya. 1.2.
Karakterisasi Makroskopik Identifikasi morfologi dilakukan pada tubuh buah segar dan spora, dan akar
ektomikoriza pelawan menggunakan metode Brundrett et al. 1996 dan Largent et al. 1978. Ciri-ciri makroskopik yang diamati diantaranya ialahkarakter
tudung bentuk, ukuran, warna, dan tekstur dari tudung, karakter pori cara pori menempel pada tangkai, bentuk, ukuran, dan warna pori, dan karakter tangkai
bentuk dan ukuran, warna, sifat permukaan, cara menempel pada media tumbuh,
ada tidaknya rhizomorf, sisa tudung, tudung universal, dan warna miselium bila ada. Karakter tersebut diamati secara langsung di lapang dan melalui hasil foto.
1.3. Karakterisasi Mikroskopik
Karakter mikroskopis yang diamati diantaranya ialah bentuk, ukuran, warna, dinding sel, dan ornamentasi spora, basidia, basidiola, pleurocystidia,
cheilocystidia, trama himenofor, pileipellis, serta ada tidaknya clamp connection menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan dilakukan menggunakan spesimen
kering yang direvitalisasi menggunakan alkohol absolute dan air, kemudian diwarnai menggunakan reagen KOH 5, larutan Melzers, dan biru trifan.
Sebagian sampel dikeringkan dan diamati setelah preparasi paraffin. Struktur pori dan permukaan akar diamati menggunakan mikroskop stereo. Spora diamati
juga menggunakan SEM. 1.4.
Preparasi Parafin Sampel akar segar dan jaringan tubuh buah dipreparasi parafin untuk
dipotong menggunakan mikrotom dengan menggunakan metode Johansen 1940 yang dimodifikasi. Sampel difiksasi sedikitnya selama 12 jam dengan FAA
formaldehid:asam asetat:alkohol5:5:90, kemudian dicuci dua kali menggunakan alkohol 70 dengan selang waktu 30 menit. Selanjutnya sampel direndam 4x
dengan alkohol 50 yang diganti setiap 1 jam.Sampel kemudian direndam dalam larutan Johansen.Larutan Johansen I digunakan 2 jam, Johansen II semalam, dan
Johansen III-V masing-masing 2 jam. Johansen VI digunakan semalam, lalu diulang 3x masing-masing selama 2 jam. Johansen VII dibiarkan di suhu ruang
selama 4 jam, kemudian diinkubasi pada suhu 58°C semalaman. Penanaman parafin dilakukan bertahap pertama selama 5 jam, lalu parafin diganti selama 6
jam, kemudian selama semalam. Parafin terakhir ditanamkan selama 3 jam, baru dilakukan pengotakan. Setelah membeku sempurna kotak parafin dimasukkan ke
dalam larutan Gifford asam asetat: alkohol: gliserin 10:90:5 untuk pelunakan. Sampel kemudian disayat dengan ketebalan 5-
12 m dengan menggunakan mikrotom. Sayatan kemudian diwarnai dengan biru trifan.
2. Analisis Sekuens ITS rDNA Jamur Pelawan
2.1. Ekstraksi dan Kuantifikasi DNA
DNA yang diamplifikasi dan disekuens berasal dari spesimen jamur pelawan yang memiliki ciri-ciri tudung berwarna merah tua, warna pori kuning,
tangkai berwarna merah tua dengan permukaan berjalur atau berjala, dan spora retikulat.
DNA genom total diekstraksi berdasarkan metode CTAB Sambrook et al. 1989 dan yang dimodifikasi menggunakan buffer Raeder Broda 1985.
Sekitar 200 mg tubuh buah yang telah disterilisasi permukaan digerus dengan menggunakan nitrogen cair. Tepung hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung
mikro yang berisi 600 l buffer CTAB CTAB, 2 PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, 2 M NaCl dan 200 mM β-merkapto etanolBME yang telah
dipanaskan, kemudian disimpan pada suhu 65° C selama 30-60 menit. Setelah didinginkan, larutan ditambah dengan volume yang sama dari fenol: kloroform:
isoamil alkohol 25:24:1, vv, kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 10.000 rpm. Larutan ditambah kloroform: isoamil alkohol 24:1, vv
lalu disentrifugasi 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru, ditambah 0.6 volume isopropanol dan dibolak-baik lalu diendapkan selama 30-60
menit di freezer. Endapan diperoleh dengan sentrifugasi 10.000 rpm selama 15 menit, pelet dicuci dengan 70 etanol dan disentrifugasi 5 menit. Pelet yang
didapat dikeringkan kemudian diresuspensi dengan 20- 50 l air steril. Setelah
DNA larut ditambahkan 0,1 volume RNAse 10 lU dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C.Selanjutnya, enzim diinaktivasi dengan memanaskan
tabung pada suhu 70°C selama sekitar 10 menit. Kualitas dan jumlah konsentrasi DNA ditentukan dengan spektrofotometri
pada nilai absorbansi 260 dan 280 nm dengan empat ulangan. Keutuhan DNA dilihat dengan eletroforesis pada 100V, selama 30 menit pada media agarosa 1
dengan buffer TAE 1x. Marker 1Kb digunakan sebagai penanda DNA genom,
sedangkan marker digunakan untuk standar hasil PCR.
2.2. Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi DNA daerah ITS rDNA dilakukan menggunakan primer ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG dan ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC.
Komposisi PCR berjumlah 50 l yang terdiri dari 5 l 10 x buffer PCR, 5 l campuran 10 M dNTP masing-masing 10 l, 1.25 l 10 M setiap primer, 1 g
DNA cetakan, dan 0. 25 l Taq DNA polymerase 5U l. Reaksi PCR ialah pra
denaturasi pada 95°C selama 5 menit, denaturasi 95°C selama 1 menit, annealing 52°C selama 1 menit, elongasi 72°C selama 2 menit, pasca PCR 72°C selama 10
menit, dan pendinginan 15°C selama 10 menit. 2.3.
Sekuensing DNA Sekuensing dilakukan dengan bantuan PT. Genetika Science Indonesia,
Jakarta.DNA murni disekuen menggunakan metode Sanger dengan alat ABI 3730XL Sambrook et al. 1989.
2.4. Analisis BLAST Sekuens ITS rDNA
Hasil sekuensing dianalisis dan ditentukan homologinya dengan spesies- spesies yang telah ada di Bank Genmenggunakan program Clustal W Bioedit dan
BLAST Altscchul
et al.
1997 dengan
bantuan situs
NCBI http:www.ncbi.nlm.nih.gov. dan Mycobank www.mycobank.com.
2.5. Analisis Filogenetik
Analisis filogenetik dilakukan dengan membandingkan hasil sekuensing daerah ITS rDNA jamur pelawan dengan sekuens-sekuens hasil BLAST-nya yang
telah ada di Bank Gen. Sekuens diekstrak menggunakan program Clustal W bioedit sedangkanpohon filogeni dikonstruksi dengan MEGA 4 Tamura et al.
2007. Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan daerah ITS DNA ribosom untuk menentukan spesies yang memiliki kekerabatan terdekat dari jamur
pelawan.
3. Karakterisasi Struktur Ektomikoriza simbion
Akar yang melekat pada tubuh buah dikarakterisasi dengan diamati di bawah mikroskop stereo dan mikroskop cahaya. Tipe percabangan akar diamati
di bawah mikroskop stereo, sedangkan struktur mantel dan jala Hartig diamati di bawah mikroskop cahaya dengan penyayatan secara memanjang dan radial.
Pewarnaan akar dilakukan dengan pewarna biru trifan merujuk pada metode Brundrett et al. 1996. Tipe percabangan dan struktur mantel diamati
berdasarkan metode Agerer 1991. Sayatan akar dipreparasi dengan metode parafin.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Karakteristik Morfologi Jamur Pelawan
A. Deskripsi morfologi jamur Pelawan
Heimioporus sp. Tudung berdiameter 1.51-14.2 cm, cembung, agak berbentuk payung
sampai mendatar, halus atau retak, kering, agak mengkilat saat basah, merah marun tua, merah kecokelatan, sebagian kuning kecokelatan, sering dengan
bagian tepian berwarna kuning. Daging tudung tebalnya 1.2-8.4 mm, krem, kuning muda pucat,atau putih kemerahan, tidak berubah kebiruan saat terpapar
udara atau agak biru. Pori hampir bebas sampai bebas, diameter 0.25-1.8 mm, bersiku atau agak bulat, merah tua, kuning muda pucat sampai kuning kehijauan;
tinggi tabung pada bagian pusat 0.41-0.73 cm dan bagian tengah 0.67-1.65 cm, kuning muda, kuning kemerahan sampai kuning kehijauan, tepian rata. Tangkai
berdiameter atas 0.32-1.3 cm, tengah 0.48-1.5 cm dan bawah 0.58-1.6 cm, panjang 4.54 sampai 12.7 cm, letak di pusat, permukaan berlajur seiring panjang
atau berjala dangkal sampai agak dalam, merah marun tua, merah kecokelatan, atau merah muda, puncak kuning tepat di bawah tudung, dasar ada yang kuning
atau hijau kecokelatan, daging tangkai kuning, krem atau kemerahan, tidak berubah saat terpapar udara atau sedikit membiru, padat atau berongga, kering,
miselium berwarna putih atau krem menutupi bagian dasar atau sampai bagian atas tangkai.
Basidiospora 8.67-12 x 6-7.658.58 m n=24, x 10.14 + 0.95 x 7.09 + 0.50, Q= 1.43, bulat telur memanjang-lonjong, berjala yang menonjol 1-2.5 m,
kuning madu, dekstrinoid, dinding tipis. Basidia 12.75-33.15 x 8.67-15.3 m, clavatus, dinding tipis, bening, 2, 3-4 spora, sterigmata 3.5-10 m. Basidiola 15.3-
26.78 x 7.65-20 m, clavatus, dinding tipis, bening. Cheilocystidia 39.78-58.65 x 5.1-20 m, berbentuk seperti botol, dinding tipis, bening. Pleurocystidia 25.58-
35.47 x 12.01-12.85. Pileipelis berupa jaringan palisade dengan pileocystidia 22.95-56.1 x 5-12.75 m, clavatus atau dermatocystidia piriformis, hifa bersekat,
lebar 2.55- 5.5 m, dinding tipis, bening. Caulocystidia 17.85-22.95 39.78 x 5.5- 12.41 m, berbentuk clavatus, fusiformis atau lageniformis, hifa bersekat 17.85
