d Kadar protein AOAC, 2005
Sampel rumput laut ditimbang kurang lebih 1,5 gram kemudian masukkan ke dalam labu kjeidhal 100 ml. Sebanyak 0,25 gram selenium dan 10 ml H
2
SO
4
kemudian didestruksi pemanasan hingga mendidih sampai larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Larutan tersebut didinginkan, sebanyak 10 ml
ditambahkan 100 ml aquades. Destilasi dengan desilator dengan suhu 100 C
dengan menambahkan 10 ml NaOH 40. Hasil desilasi dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang telah berisi 100 ml asam borat 4. Larutan yang telah
didestilasi kemudian dititrasi dengan menggunakan HCl 0,1013 N sampai terjadi perubahan warna merah muda kembali. Perhitungan kadar protein dapat dihitung
dengan menggunakan formula :
N =
ml HCl − ml blanko x N HCl x 14.000 x 10 gram sampel x 1000
x 100
Kadar protein = N x 6.25
3.3.4 Ekstraksi Senyawa Bioaktif Pramadhany, 2006 dalam Romansyah,
2010 Metode ekstraksi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah metode
ekstraksi tunggal. Ekstraksi tunggal ini menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu heksana p.a untuk pelarut nonpolar, etil asetat p.a
untuk pelarut semipolar serta metanol p.a untuk pelarut polar. Sampel rumput laut kemudian ditimbang sebanyak 25 gram. Sampel tersebut kemudian dipotong-
potong menjadi kecil untuk memperluas permukaannya sehingga akan
memperluas kontak dengan pelarut. Hal tersebut bertujuan untuk memaksimalkan proses ekstraksi komponen bioaktif Sudirman, 2011. Sampel rumput laut yang
telah dipotong kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer untuk diberi pelarut sebanyak 100 ml. Masing-masing sampel rumput laut diberi dengan pelarut yag
berbeda. Perbandingan sampel rumput laut dengan pelarut adalah 1 : 4 wv. Maserasi selama 1x24 jam campuran sampel dan pelarut dengan
menggunakan orbital shaker. Hasil maserasi kemudian disaring dengan kertas saring whatman 42 yang akan menghasilkan filtrat dan residu. Filtrat kemudian
dievaporasi pada suhu 50 C. Hasil dari evaporasi ini adalah tiga ekstrak kasar
yang masing-masing dari pelarut berbeda yaitu ekstrak kasar heksana p.a, ekstrak kasar etil asetat p.a dan ekstrak kasar metanol p.a. Diagram alir proses ekstraksi
bertingkat dapat dilihat pada Gambar 7.
3.3.5 Uji Aktivitas Antioksidan Salazar-Aranda et al., 2009
Uji aktivitas antioksidan rumput laut dari masing-masing ekstrak kasar pelarut yang berbeda menggunakan metode DPPH 1,1 diphenyl 2-picryhydrazil
yang diacu dalam Salazar-Aranda, et al.2009 dengan modifikasi. Ekstrak kasar dari masing-masing pelarut diencerkan berbagai konsentrasi dengan larutan
etanol. Larutan DPPH dibuat dengan menggunakan kristal DPPH sebanyak 1,25 mg yang dilarutkan dalam larutan etanol 25 ml. Larutan heksana p.a, etil asetat
p.a, dan metanol p.a dicampurkan dengan larutan DPPH dalam microwell. Perbandingan volume yang digunakan adalah 1:1 vv yaitu 200 µl dengan
komposisi 100 µl larutan DPPH dan l00 µl dari masing-masing konsentrasi larutan. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37
C selama 30 menit dan diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan panjang gelombang 517 nm.
Gambar 7. Proses Ekstraksi Kasar Rumput Laut Pramadhany, 2006 dalam Romansyah, 2010
Rumput laut sebanyak 25 gram
Penambahan 100 ml heksana p.a
Penambahan 100 ml etil asetat p.a
Penambahan 100 ml metanol p.a
Filtrasi
Residu Filtrat
Evaporasi
Ekstrak kasar heksana p.a
Ekstrak kasar etil asetat p.a
Esktrak kasar metanol p.a
Maserasi 1 x 24 Jam
Pembanding yang digunakan adalah vitamin C yang diencerkan dengan berbagai konsentrasi. Larutan blanko dibuat dengan menggunakan 100 µl etanol
dan 100 µl larutan DPPH. Diagram alir uji aktivitas antioksidan disajikan pada Gambar 8. Aktivitas antioksidan masing-masing larutan pada setiap konsentrasi
dan larutan Vitamin C dinyatakan dengan persentase penghambatan radikal bebas persen inhibisi yang dapat dihitung dengan menggunakan formula sebagai
berikut :
inhibisi = absorbansi blanko
− absorbansi sampel absorbansi blanko
x 100
Nilai konsentrasi sampel dari masing-masing larutan heksana, etil asetat, dan metanol dan pembanding vitamin C serta hambatan radikal bebas
inhibisi diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a +bx yang
digunakan untuk mencari nilai IC
50
inhibator concentration 50 dengan y sebesar 50 dan x menyatakan nilai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan bahwa konsentrasi larutan yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50
Safitri, 2010.
Gambar 8. Proses Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Perhitungan nilai IC
50
Pengukuran dan perhitungan nilai absorbansi Inkubasi
Pencampuran dengan DPPH Pengenceran
Pembuatan larutan stok Ekstrak kasar masing-masing larutan
28
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
