3.8.3 Aktifitas Fagositik Anderson dan Siwicki 1993
Hemolim 0.1 ml dimasukkan kedalam mikroplate dan dicampur secara merata dengan 25 μl bakteri
Staphylococcus aureus dan diinkubasi selama 20 menit. Hemolim sebanyak 5 μl diteteskan pada objek glas dan dibuat preparat ulas
lalu dikeringkan. Fiksasi dengan metanol 100 selama lima menit dan diwarnai dengan giemsa selama 15 menit. Aktivitas fagositik diukur berdasarkan persentase
sel-sel fagosit yang melakukan fagositosis. Aktifitas fagositik dihitung dengan menggunakan rumus :
3.8.4 Aktifitas Phenoloxidase PO Liu and Chen 2004
Aktifitas phenoloxidase
diukur menggunakan
spektrofotometer. Pengamatan dilakukan dengan melihat perekaman pembentukan dopachrome
yang dihasilkan dari
L
-dihydroxyphenylalanine
L
-DOPA. Hemolim disentrifuse pada 1000 rpm pada suhu 4
o
C selama 20 menit. Cairan supernatan dibuang dan pellet dibilas dengan cacodylate-citrate buffer hingga 1 ml sodium cacodylate
0.01 M, sodium chloride 0.45 M, trisodium citrate 0.10 M, pH 7.0 kemudian disentrifus ulang. Pellet selanjutnya dicampur dengan cacodylate buffer hingga
200 µl sodium cacodylate 0.01 M, sodium chloride 0.45 M, calcium chloride 0.01 M dan magnesium chloride 0.26 M, pH 7.0. Larutan kemudian dibagi dua,
Larutan pertama sebanyak 100 µl diinkubasi selama 10 menit pada suhu 25
o
C dengan 50 µl trypsin 1 mg ml
-1
, sebagai elicitor kemudian ditambahkan 50 µl
L
DOPA, dan lima menit kemudian dicampur 800 µl cacodylate buffer. Larutan kedua sebanyak 100 µl suspensi sel dicampur dengan 50 µl cacodylate buffer
untuk menggantikan trypsin dan 50 µl
L
-DOPA yang digunakan sebagai kontrol untuk background aktifitas phenoloxidase pada semua kondisi uji.
Optikal density OD diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Aktifitas phenoloxidase udang diekspresikan sebagai
pembentukan dopachrome per 50 µl hemolim.
3.8.5 Pemeriksaan Virus dengan Metode PCR
Pemeriksaan virus dengan metode PCR dilakukan guna mengkonfirmasi keberadaan virus pada udang vaname uji yang akan digunakan dalam perlakuan
dan pada saat setelah diinfeksi. Pemeriksaan virus dengan metode PCR menggunakan metode standar dari OIE 2009.
3.8.6 Pemeriksaan Gejala Klinis
Pemeriksaan gejala klinis dilakukan setelah infeksi dengan IMNV. Pengamatan gejala klinis dilakukan melalui skoring berdasarkan jenis perubahan
gejala yang terjadi Angka 2005. Parameter gejala klinis yang digunakan berdasarkan modifikasi dari penentuan kelompok gejala klinis dalam
Costa 2009, yaitu terinfeksi tanpa symptom termasuk kategori tingkat infeksi ringan dengan skor +, gejala dengan sedikit warna putih lebam di dalam jaringan
pada bagian beberapa segmen abdomen termasuk kategori menengah dengan skor ++, gejala dengan sebagian besar jaringan abdomen berwarna putih lebam
termasuk kategori berat dengan skor +++ dan gejala dengan bagian abdomen dari arah ekor berwarna merah jaringan mati termasuk kategori berat dengan
skor ++++.
3.8.7. Histopatologi
Histopatologi diambil dari jaringan otot skeletal dan hepatopankreas udang pada setiap akhir pengamatan setelah infeksi. Sampel udang yang digunakan
diambil dari setiap perlakuan untuk mengetahui tingkat kerusakan jaringan yang terjadi akibat IMNV dan pengaruh perlakuan yang diberikan. Organ dan jaringan
yang diambil dari udang uji difiksasi terlebih dahulu dengan larutan fiksatif Davidson minimal satu hari. Kemudian organ dipotong 3-5 mm dan 1 x 1 cm,
selanjutnya dilakukan dehidrasi, clearing, impregnasi, embedding dan blocking paraffin. Block jaringan selanjutnya diiris menggunakan mikrotom setebal 5 µm
dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin.
Kategori