3.6.2 Menguji Pengaruh Pemberian Kappa-Karagenan terhadap Resistensi Udang Vaname dari Serangan IMNV
Resistensi udang vaname diamati setelah udang vaname yang diberi
perlakuan selama empat minggu, diinfeksi dengan IMNV. Udang vaname yang telah diberi perlakuan pakan yang ditambahkan k-karagenan dengan dosis berbeda
selama empat minggu, selanjutnya diinfeksi dengan IMNV secara oral. Pada tahap ini terdiri dari tiga perlakuan dan kontrol kontrol positif dan kontrol
negatif, dengan masing-masing tiga ulangan. Udang vaname yang diinfeksi telah mencapai ukuran 10.77±1.32 g. Penginfeksian IMNV berdasarkan prosedur
infeksi IMNV subbab 3.5. Setelah diinfeksi IMNV, udang vaname diberi pakan udang komersial dan diamati selama dua minggu. Pengamatan yang dilakukan
meliputi kelangsungan hidup, gejala klinis dan histopatologi serta konfirmasi keberadaan IMNV pada udang vaname dengan PCR polymerase chain reaction.
3.7 Prosedur Penelitian Tahap Dua 3.7.1 Mengevaluasi Frekuensi Pemberian Kappa-Karagenan terhadap
Resistensi Udang Vaname dari Serangan IMNV
Penelitian tahap dua adalah menentukan frekuensi pemberian k-karagenan dengan menggunakan dosis terbaik C: 15 g kg
-1
pakan yang didapatkan pada penelitian tahap satu. Penelitian tahap dua ini terdiri dari perlakuan :
Kontrol + dan - : Pemberian pakan tanpa k-karagenan Perlakuan C1
: Pemberian k-karagenan setiap hari selama lima minggu Perlakuan C7
: Pemberian k-karagenan selama tujuh hari secara berulang dengan interval pemberian tujuh hari minggu ke-1,3,5
Perlakuan C14 : Pemberian k-karagenan selama 14 hari secara berulang
dengan interval pemberian tujuh hari, pada minggu ke-1 dan 4
Pemberian perlakuan berlangsung selama lima minggu, menggunakan udang vaname berukuran 4.2±0.32 g. Pengamatan pertumbuhan dilakukan setiap
minggu selama perlakuan, yaitu minggu ke-0 sampai 5 perlakuan. Selanjutnya udang vaname diinfeksi dengan IMNV berdasarkan prosedur infeksi IMNV
subbab 3.5. Udang vaname yang diinfeksi dengan IMNV telah mencapai ukuran
12.2±1.01 g. Pemeliharaan setelah infeksi menggunakan pakan komersial berlangsung selama selama dua minggu. Pengamatan resistensi meliputi
kelangsungan hidup, gejala klinis, histopatologi, serta konfirmasi keberadaan IMNV dengan PCR.
3.8 Pengukuran Parameter Pengamatan
Parameter pengamatan dalam penelitian ini meliputi parameter imun, pemeriksaan gejala klinis, histopatologi dan kelangsungan hidup serta konfirmasi
keberadaan IMNV dengan PCR pada udang vaname. Sebagai data penunjang dilakukan pula pengukuran pertumbuhan. Parameter imun yang diukur adalah
total hemosit, diferensiasi hemosit, aktifitas fagositosis, dan phenoloksidase.
3.8.1 Total Hemosit Blaxhall dan Daishley 1973
Hemolim diambil sebanyak 0.1 ml dibagian pangkal kaki jalan ke-5 dengan syringe 1 ml yang sudah berisi antikoagulan Na-sitrat sebanyak 0.3 ml,
kemudian dihomogenkan selama lima menit. Tetesan pertama hemolim pada syringe dibuang, selanjutnya hemolim diteteskan ke haemositometer dan dihitung
jumlah selnya per ml dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40 kali. Total hemosit dihitung dengan menggunakan rumus :
Total Hemosit Keterangan:
FP = Faktor Pengenceran
3.8.2 Diferensiasi Hemosit Martin dan Graves 1995
Hemolim yang telah diambil dari udang uji diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, kemudian dikeringkan di udara dan difiksasi dengan metanol
100 selama lima menit. Setelah itu dikeringkan udara kembali dan diwarnai dengan larutan giemsa 10 selama 10 menit, dicuci dalam air mengalir selama 30
detik dan dibiarkan kering. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 100 kali dan dibedakan menurut jenisnya yaitu sel hialin,
semi granular dan granular. Persentase jenis hemosit dihitung dengan menggunakan rumus :
Persentase Jenis Sel Hemosit
3.8.3 Aktifitas Fagositik Anderson dan Siwicki 1993
Hemolim 0.1 ml dimasukkan kedalam mikroplate dan dicampur secara merata dengan 25 μl bakteri
Staphylococcus aureus dan diinkubasi selama 20 menit. Hemolim sebanyak 5 μl diteteskan pada objek glas dan dibuat preparat ulas
lalu dikeringkan. Fiksasi dengan metanol 100 selama lima menit dan diwarnai dengan giemsa selama 15 menit. Aktivitas fagositik diukur berdasarkan persentase
sel-sel fagosit yang melakukan fagositosis. Aktifitas fagositik dihitung dengan menggunakan rumus :
3.8.4 Aktifitas Phenoloxidase PO Liu and Chen 2004
Aktifitas phenoloxidase
diukur menggunakan
spektrofotometer. Pengamatan dilakukan dengan melihat perekaman pembentukan dopachrome
yang dihasilkan dari
L
-dihydroxyphenylalanine
L
-DOPA. Hemolim disentrifuse pada 1000 rpm pada suhu 4
o
C selama 20 menit. Cairan supernatan dibuang dan pellet dibilas dengan cacodylate-citrate buffer hingga 1 ml sodium cacodylate
0.01 M, sodium chloride 0.45 M, trisodium citrate 0.10 M, pH 7.0 kemudian disentrifus ulang. Pellet selanjutnya dicampur dengan cacodylate buffer hingga
200 µl sodium cacodylate 0.01 M, sodium chloride 0.45 M, calcium chloride 0.01 M dan magnesium chloride 0.26 M, pH 7.0. Larutan kemudian dibagi dua,
Larutan pertama sebanyak 100 µl diinkubasi selama 10 menit pada suhu 25
o
C dengan 50 µl trypsin 1 mg ml
-1
, sebagai elicitor kemudian ditambahkan 50 µl
L
DOPA, dan lima menit kemudian dicampur 800 µl cacodylate buffer. Larutan kedua sebanyak 100 µl suspensi sel dicampur dengan 50 µl cacodylate buffer
untuk menggantikan trypsin dan 50 µl
L
-DOPA yang digunakan sebagai kontrol untuk background aktifitas phenoloxidase pada semua kondisi uji.
Optikal density OD diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Aktifitas phenoloxidase udang diekspresikan sebagai
pembentukan dopachrome per 50 µl hemolim.
