18
3.2.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahap yaitu : Tahap pertama adalah produksi IgY spesifik Streptococcus sobrinus IgY-Ss pada telur ayam dan tahap
kedua adalah uji biologis IgY-Ss sebagai anti adhesi dan opsonin.
Tahap Pertama 1 Re-Karakterisasi dan Identifikasi bakteri
Bakteri di tumbuhkan pada media agar darah dan diinkubasi pada suhu 37 C
selama 24-48 jam. Kemudian bakteri di identifikasi menggunakan kit Microgen
TM
GN- ID Identification Microgen.
2 Preparasi Antigen Utuh Isolat bakteri ditumbuhkan pada 1000 ml media BHI dan diinkubasi pada suhu
37 C selama 18 jam. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10
menit. Pelet diresuspensikan dengan 5 ml NaCl, disentrifugasi pada 10000 rpm 10 menit, dilakukan 2 kali. Pelet dilarutkan dalam 5 ml NaCl, dihomogenkan dan diukur
pada 620 nm dengan transmisi 10 konsentrasi selnya untuk menentukan kandungan bakteri 10
9
selml. Suspensi diinaktifkan dalam penangas air dengan suhu 52
C selama 60 menit, didinginkan dan siap digunakan sebagai antigen untuk memproduksi antibodi Estuningsih 1998.
3 Produksi Antibodi MS pada Ayam Produksi antibodi menggunakan 4 ekor ayam petelur Single Comb Brown
Leghorn betina berumur 24 minggu yang siap bertelur. Ayam diimunisasi dengan 0,5 ml 10
9
CFU suspensi S. sobrinus secara intravena Carlander 2002 selama tiga hari berturut-turut. Kemudian dilanjutkan dengan menyuntik 1 ml 10
9
CFU suspensi bakteri S. sobrinus dalam Freund adjuvant complete pada minggu II, serta
1 ml 10
9
CFU suspensi bakteri S. sobrinus dalam Freund adjuvant incomplete minggu III dan IV secara intramuskular Wibawan Laemmler 1992. Adjuvan dapat
memperbesar respon imun bila disuntikan bersama-sama dengan imunogen karena ia memperluas permukaan antigen dan memperlama penyimpanan antigen didalam
19
tubuh. Satu minggu kemudian dilakukan koleksi serum dan diperiksa keberadaan antibodinya. Identifikasi ulang serum dan kuning telur menggunakan uji agar gel
presipitasi AGP. 4 Persiapan Antigen Terlarut untuk Uji Agar Gel Presipitasi
Isolat bakteri ditumbuhkan pada 50 ml media BHI, diinkubasi pada suhu 37 C
selama 18 jam. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensikan dengan 5 ml NaCl, disentrifugasi pada 10000 rpm
dilakukan 2 kali. Pelet dicuci, ditambah 0,5 ml HCl 0,2 N kemudian ditangas pada suhu 52
C selama 1 jam. Selanjutnya homogenat dititrasi dengan NaOH 1 N, menggunakan indikator Phenol Red warna homogenat awal kuning titrasi hingga
merah seperti phenol red. Suspensi disentrifugasi pada 10 000 rpm selama 10 menit, dilakukan 2 kali. Supernatan digunakan sebagai antigen terlarut Wibawan
Laemmler 1992.
5 Uji Agar Gel Presipitasi Agar gel dibuat dengan melarutkan 0.4 g agarose dan 1.2 g Poly Ethylene
Glycol PEG 6000, 0.1 Na azide dalam 25 ml PBS pH 7.4 dan 25 ml akuades pH 7.4. Larutan ini dipanaskan dalam penangas air sampai larut dan warna larutan
menjadi bening. Kemudian larutan dipipet sebanyak 3.75 ml, di cetak pada gelas obyek dan ditunggu sampai mengeras. Kemudian dibuat sumur-sumur dengan gel
puncher. Pada sumur tengah dimasukkan antigen 25 l dan 25 l antibodi dari serum atau IgY pada sumur sekelilingnya. Gelas obyek diletakkan di atas kertas
saring basah agar terjaga kelembabannya. Reaksi dibaca setelah 18 sampai 48 jam, reaksi positif ditunjukkan dengan adanya garis presipitasi diantara sumur antigen
dan antibodi. 6 Ekstraksi dan Purifikasi IgY dari Kuning Telur Ayam
Kuning telur dipisahkan dari bagian putih telur, kemudian diletakkan di atas kertas saring untuk menghilangkan putih telur yang melekat. Membran kuning telur
dilubangi dengan cara diangkat dengan pinset, cairan kuning telur ditampung pada gelas beker dan dilarutkan secara perlahan dalam milli-Q pH 4 dengan
perbandingan 1 : 4. Setelah homogen ditambahkan lagi milli-Q pH 2 hingga pH
20
suspensi 5.0 sampai 5.2 dan di simpan pada suhu 4
o
C minimal 12 jam. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3125 g pada suhu 4
o
C selama 20 menit dan supernatan diambil dan diperoleh Water Soluble Fractination WSF. Selanjutnya
WSF dibuat hingga pH 7.5. Kemudian ekstraksi dilanjutkan PEG 6000 dan amonium sulfat Polson et al. 1980. WSF ditambahkan PEG 6000 sehingga konsentrasi akhir
12 wv. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit suhu 20
o
C. Pelet ditambahkan dengan amonium sulfat 40 sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 700 g selama 15 menit, dilakukan 3 kali. Pelet
disuspensikan dengan PBS sebanyak 1 ml, dan ditambahkan dua tetes 0.1 Na Azide. Suspensi didialisis selama 24 jam dengan PBS pH 8.0.
Purifikasi dilakukan dengan fast protein liquid chromatography menggunakan alat Akta Explorer 10S Amersham menggunakan kolom Hi-trap IgY . Matriks dalam
kolom dibilas dengan Buffer K
2
SO
4
20 mM dalam larutan NaH
2
PO
4
20 mM pH 7.5 . Imunoglobulin kuning telur IgY hasil purifikasi dimasukkan ke dalam kolom,
bersamaan dengan buffer K
2
SO
4
20 mM. Proses pertama adalah pengikatan IgY, matriks akan mengikat IgY sedangkan protein selain Ig Y akan lolos dan dibuang.
Tahap kedua adalah proses elusi IgY menggunakan buffer NaH
2
PO
4
20 mM pH 7.5 sebagai larutan elusi. IgY yang terelusi akan terdeteksi oleh monitor
absorban yang ditandai dengan naiknya garis sampai terbentuk garis puncak. Larutan inilah yang ditampung dalam tabung reaksi, dan merupakan IgY murni.
Matriks dicuci dengan buffer pembersih larutan 30 propanol dalam NaH
2
PO
4
20 mM pH 7.5.
7 Penentuan Konsentrasi dan Berat Molekul IgY Absorbansi sampel ditentukan dengan pembacaan pada UV spektrofotometer
pada 280 nm. Konsentrasi sampel dihitung berdasarkan kurva larutan standard dengan Bovine Serum Albumin yang telah dibuat.Untuk mengetahui berat molekul
IgY dilakukan SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis. SDS-PAGE dengan menggunakan sistem diskontinu, terdiri atas
gel pemisah konsentrasi 12 dan gel pengumpul 14 . Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi berat molekul protein berdasarkan perbandingan
dengan marker umum berat molekul.
21
Tahap kedua
8 Aktifitas Biologis Ig Y sebagai Anti Adhesi In Vitro Aktifitas biologis IgY-Ss dalam perannya sebagai anti adhesi ditentukan
dengan menggunakan assay adhesi Wibawan et al. 1999. Sebelumnya ditentukan juga kemampuan adhesi bakteri S. sobrinus pada sel epitel pipi. Kemampuan adhesi
dilakukan dengan cara : bakteri diinkubasikan pada suhu 37 C selama 1 jam
dengan sel epitel dengan perbandingan sel epitel pipi 10
5
selml : bakteri 10
7
CFUml. Uji anti adhesi menggunakan prosedur yang sama dengan uji adhesi, dengan perbedaan yaitu sebelum bakteri di infeksikan kedalam biakan sel epitel,
bakteri diinkubasi dengan IgY-Ss pada suhu 37 C selama 1 jam. Dosis IgY yang
digunakan adalah 100 g. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang kemudian pelet ditambahkan dengan 0,5 ml
PBS. Buat preparat ulas, difiksasi dengan metanol selama 15 menit, diwarnai dengan Giemsa selama 60 menit, lalu dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 1000 kali. Penentuan nilai adhesi adalah rataan jumlah bakteri yang melekat pada 20 sel epitel pipi yang teramati.
9 Aktifitas IgY sebagai Opsonin In vitro Untuk mengetahui peran IgY sebagai opsonin ditunjukkan dalam assay
fagositosis. Assay fagositosis dilakukan menurut metode Utama et al. 2000 dengan modifikasi.
a. Preparasi Makrofag Makrofag yang dipergunakan dalam penelitian ini akan menggunakan
makrofag yang berasal dari peritoneum mencit. Makrofag didapat dengan cara menyuntikkan cairan PBS dan IgY sebanyak 0.5 ml secara intraperitoneal. Setelah
inkubasi selama satu jam kemudian dilakukan pembedahan pada mencit untuk memanen cairan peritoneumnya. Kemudian jumlah makrofag dihitung menggunakan
hemositometer. Jumlah makrofag yang akan digunakan dalam bahan coba fagositosis adalah 10
5
selml.
22
b. Assay Fagositosis Untuk melihat kemampuan fagositosis dilakukan dengan cara : suspensi
makrofag 0.5 x 10
5
selml dan 0.5 x 10
8
selml bakteri ditempatkan pada tabung mikro, kemudian diinkubasi selama 1 jam suhu 37
o
C. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang kemudian pelet
ditambahkan dengan 0,5 ml PBS. Buat preparat ulas, difiksasi dengan metanol selama 15 menit, diwarnai dengan Giemsa selama 60 menit, lalu dilihat di bawah
mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 kali.Uji opsonin menggunakan prosedur yang sama dengan assay fagositosis, namun sebelum bakteri di campurkan dengan
makrofag, bakteri di inkubasi dengan IgY-Ss pada suhu 37
o
C selama 1 jam. c. Penentuan Nilai Aktifitas dan Kapasitas Fagositosis
Untuk melihat proses fagositosis dihitung nilai aktifitas fagositosis persentase jumlah makrofag aktif dari jumlah makrofag total serta nilai kapasitas
fagositosis rataan jumlah bakteri S. sobrinus yang dimakan oleh 20 makrofag aktif. 10 Analisa Statistik
Hasil penelitian ini dianalisa secara deskriptif menggunakan uji statistik t uji dua pihak dengan taraf nyata α = 0,05. Uji t ini merupakan salah satu uji untuk
pengujian hipotesis Sudjana 1992.
23
IV H
ASIL
D
AN
P
EMBAHASAN
4.1 Re-Karakterisasi Isolat Bakteri
Kategori