3.5 Cara pengambilan sampel penelitian
Cara pengambilan sampel penelitian dilakukan menggunakan metode consecutive sampling.
3.6 Identifikasi variabel
3.6.1 Variabel bebas : Pemeriksaan kadar antibodi IgM anti PGL-1
dengan metode ELISA dari sampel serum darah yang diambil dari vena kubiti tanpa
kertas saring, pemeriksaan kadar antibodi IgM anti PGL-1 dengan metode ELISA dari sampel
darah finger prick dengan kertas saring. 3.6.2 Variabel terikat :
Kadar antibodi IgM anti PGL-1 dengan metode ELISA pada penderita kusta
multibasiler dan pausibasiler.
3.7 Kriteria inklusi dan eksklusi A. Kriteria inklusi
a. Bersedia ikut serta dalam penelitian dengan menandatangani informed consent.
b. Penderita kusta tipe multibasiler dan pausibasiler yang ditetapkan secara klinis dan bakteriologis.
c. Penderita kusta dengan usia 14 tahun keatas.
B. Kriteria eksklusi
a. Penderita kusta yang tidak bersedia mengikuti penelitian.
b. Terjadi kesulitan dalam pengambilan sampel darah.
3.8 Alat, bahan dan cara kerja
3.8.1 Alat dan bahan untuk pengambilan spesimen
1. Sarung tangan. 2. Alat ikat pembendungan torniquet.
3. Kapas alkohol 70. 4. Spuit disposable 3 cc.
5. Vacutainer tabung pengumpul darah steril 5 cc. 6. Auto click blood lancet.
7. Kertas saring Whattman chromathography paper Gr. 41. 8. Kertas label.
9. Plastik klip. 10. Spidol.
11. Tabung mikrokapiler hematocrite tube. 12. Microtube tabung mikro 1 ml yang berisi bahan pengawet NaNO3
untuk sampel serum. 13. Plester luka.
14. Satu buah freezer. 15. Satu buah centrifuge.
16. Kotak pendingin untuk menyimpan serum dan kertas saring pada saat transportasi ke laboratorium pusat.
17. Dry ice.
3.8.2 Alat dan bahan untuk pemeriksaan serologi kusta dengan metode ELISA
1. Immunowash BIORAD model 1575
2. Microplate.
3. Mikropipet.
4. Gunting kertas.
5. Vortex.
6. Blocking buffer.
7. ELISA reader SUNRICE classic.
8. Tabung Eppendorf 1,5µl, 0,5µl.
9. Kotak inkubasi.
10. Kertas saring Blood Whattman paper.
11. Larutan buffer PBST phosphate buffer saline tween +0,05 tween
20.
3.8.3 Cara kerja
A. Penderita kusta
Pasien yang memenuhi kritria inklusi dilakukan pemeriksaan untuk menentukan klasifikasi menurut WHO 1988 ataupun mendapatkan
data skunder yaitu dari data rekam medis pasien pada saat berobat ke RS Kusta Pulau Sicanang Belawan dan RSUP H. Adam Malik Medan
B. Prosedur pengambilan sampel serum darah dari vena kubiti
tanpa kertas saring
a Pengambilan sampel darah dilakukan di RS Kusta Pulau Sicanang Belawan RSUP H. Adam Malik Medan setelah satu sampai
dua jam pasien makan dan minum. Cara pengambilan sampel
serum darah adalah sebagai berikut: gunakan sarung tangan, lalu bersihkan kulit di atas lokasi tusukan dengan alkohol 70 dan
biarkan sampai kering. Lokasi penusukan harus bebas dari luka dan bekas lukasikatrik. Pasang ikatan pembendungan pada
lengan. Setelah itu vena kubiti ditusuk dengan posisi sudut 45 derajat dengan jarum menghadap keatas. Darah dibiarkan
mengalir kedalam jarum lalu jarum diputar menghadap kebawah. Kemudian darah diambil sebanyak 3 cc. Torniquet dilepas, lalu
jarum ditarik dengan tetap menekan lubang penusukan dengan kapas alkohol. Setelah itu bekas tusukan ditutup dengan plester.
Darah kemudian dimasukkan ke dalam vacutainer 5 cc dan diberi label.
b Sampel darah disentrifugasi dengan kecepatan 2000rpm selama 5 menit untuk mendapatkan serum. Serum yang diperoleh
kemudian dimasukkan ke dalam microtube 1cc yang berisi bahan pengawet NaNO3 untuk penyimpanan serum dan diberi label.
c Serum selanjutnya disimpan pada freezer dengan suhu 0--20 C
yang akan stabil selama 6 bulan sebelum pemeriksaan. Hindari kontaminasi dan pajanan langsung terhadap sinar matahari.
C. Prosedur pengambilan sampel darah finger prick dengan
menggunakan kertas saring
a Sampel darah finger prick diambil dari jari tangan yang tidak mengalami gangguan fungsi sehingga mudah untuk mendapatkan
sampel darah.
b Dilakukan desinfeksi pada jari tangan dengan kapas alkohol 70.
c Tusuk jari dengan auto click blood lancet pada ujung
permukaan jari yang sudah didesinfeksi.
d Darah kapiler dimasukkan dalam tabung hematokrit
mikrokapiler sampai penuh 80µl. e Teteskan darah pada kertas saring sampai terserap merata dan
membentuk bulatan dan biarkan sampai kering pada suhu kamar serta diberi label.
f Kertas saring yang mengandung darah dimasukkan kedalam plastik klip dan akan stabil selama 2-4 bulan sebelum
pemeriksaan serologi. Hindari kontaminasi dan pajanan langsung terhadap sinar matahari.
D. Prosedur pengiriman sampel serum darah yang diambil dari vena kubiti dan sampel darah dari
finger prick
Masing-masing sampel selanjutnya dibawa ke Tropical Disease Center yang berlokasi di
Jalan Mulyorejo, Kampus C Universitas Airlangga Surabaya. Sampel serum dibawa
dengan menggunakan kotak pendingin berisi dry ice. Sedangkan untuk sampel kertas
saring menggunakan kotak biasa.
E. Prosedur pemeriksaan serologi dengan metode ELISA
a Kertas saring yang mengandung darah dipotong kecil-kecil. b Masukkan kedalam tabung eppendorf dan ditambahkan 800µl
PBST + NaN3 20 pengenceran 10 kali.
c Dilakukan vortex selama 5 menit untuk melarutkan serum. d Masukkan 50µl coating buffer pH 9,6 PBS dan antigen NT-P-
BSA working solution ke dalam mikroplat, inkubasi pada suhu 37
e Mikroplat dicuci dengan washing buffer berisi larutan PBST + skim milk 2 sebanyak 3 kali dengan alat BioRad Immunowash
model 1575. C selama 1 jam.
f Masukkan blocking buffer 50µl dalam mikroplat, inkubasi pada suhu 37
g Buang blocking buffer. C selama 1 jam.
h Masukkan larutan 50µl goat serum sampel serum dan larutan kertas saring yang telah diencerkan dengan dilution buffer
1:3000 kedalam mikroplat, inkubasi pada suhu 37
i Cuci mikroplat dengan washing buffer sebanyak 3 kali. C selama 1
jam.
j Masukkan masing-masing 50µl 2
nd
reagen ABC antibodi Biotinelabeled Anti Human IgM sesuai skema kedalam
mikroplat, inkubasi 37
k Cuci mikroplat kembali dengan washing buffer sebanyak 3 kali. C selama 1 jam dan diencerkan dengan
dilution buffer dengan perbandingan 1:2000.
l Masukkan substrat solution masing-masing 100µl dalam mikroplat hingga warna kuningjingga, hitung waktunya.
m Reaksi warna dihentikan setelah + 10-30 menit hitung waktu optimal perubahan warna paling baik dengan menambahkan
100µl stopping solution.
n Hitung nilai serapan optical density dengan alat ELISA reader SUNRICE classic, kemudian diolah dan dikonversikan
melalui komputer dengan program Biolise.
3.9 Definisi operasional
3.9.1 Usia : Usia subjek saat pengambilan sampel dihitung dari tanggal lahir, bila lebih
dari 6 bulan, usia dibulatkan ke atas; bila kurang dari 6 bulan, usia dibulatkan ke bawah.
3.9.2 Kusta : Penyakit kronis yang disebabkan oleh infeksi M. leprae yang menyerang
saraf tepi, tetapi bisa juga menyerang kulit, mukosa mulut, saluran nafas bagian atas, sistem retikuloendotelial, mata otot, tulang, dan testis.
3.9.3 Pemeriksaan bakteriologis : Pemeriksaan sediaan yang diperoleh lewat irisan dan kerokan kecil pada
kulit yang kemudian diberi pewarnaan tahan asam untuk melihat M. leprae 3.9.4 Enzyme linked immunosorbent assay ELISA :
Suatu tehnik biokimia digunakan terutama pada bidang imunologi untuk mendeteksi hadirnya antibodi atau antigen pada sampelnya.
3.9.5 Metode finger prick : Suatu tehnik untuk mendapatkan sampel darah untuk pemeriksaan
laboratorium dengan cara menusukkan benda tajam pada ujung jari. 3.9.6 Kertas saring :
Kertas saring adalah perangkat pengambilan sampel darah yang sekaligus sebagai media transport sampel darah untuk membantu diagnosis penyakit.
3.10 Rencana pengolahan dan analisa data
Data yang terkumpul diolah menggunakan perangkat komputer kemudian ditabulasi dan dideskripsikan dalam bentuk tabel distribusi frekwensi. Untuk menganalisa
korelasi nilai kadar antibodi IgM anti PGL-1 dari sampel darah finger prick dengan kertas saring dengan pemeriksaan menggunakan sampel serum darah yang diambil
dari vena kubiti tanpa kertas saring pada penderita kusta dilakukan uji statistik 2- tailed correlation, kemudian dilanjutkan dengan uji regresi linear sebagai dasar
untuk menghitung nilai konversi kadar antibodi IgM anti PGL-1 dari finger prick dengan kertas saring terhadap kadar antibodi IGM anti PGL-1 dari serum darah yang
diambil dari vena kubiti tanpa kertas saring. Selanjutnya dilakukan uji t-test dengan derajat kepercayaan 95 untuk melihat perbedaan nilai sampel serum darah yang
diambil dari vena kubiti tanpa kertas saring dengan nilai konversi sampel darah finger prick dengan kertas saring.
3.10 Kerangka operasional
Kategori