Hasil ukur : Nilai positif : warna kecoklatan pada membran sel target. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam skor histologis. Variabel skala numerik.
I. Alat Penelitian
Alat penelitian yang dipakai pada penelitian ini yaitu : 1. Alat pemeriksaan THT yaitu : lampu kepala, spekulum hidung, spatula lidah,
pinset bayonet, kapas, lidokain efedrin 2 . 2. Alat dan bahan melakukan biopsi nasofaring : tang biopsi
,
spekulum hidung, pinset bayonet, kapas, kasa, alat nasoendoskopi, xylocain spray 10, PBS
formalin, botol untuk menyimpan jaringan biopsi. 3. Alat untuk pengecatan imunohistokimia : Mikrotom, Poly L-Lysine glass slide
SIGMA, termometer, mounting media, microwave oven, inkubator, pipet mikro, deck glass, stop watch,
humidified chamber
, ruangan dalam kondisi kelembaban tinggi.
4. Mikroskop
OLYMPUS
seri B X 41.
J. Cara Kerja
Penderita dengan kecurigaan KNF dilakukan biopsi nasofaring dengan bantuan nasoendoskopi. Jaringan yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam
botol yang berisi PBS formalin. Botol yang berisi jaringan dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Moewardi Surakarta untuk dilakukan
pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan hematosillin eosin oleh dokter spesialis Patologi Anatomi.
Preparat dengan hasil bacaan histopatologi KNF WHO tipe 3
Undifferentiated
dilakukan pemotongan pada blok parafin setebal 4 mikron. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
Hasil masing-masing kelompok blok parafin dipotong menjadi slide dan digunakan
untuk pemeriksaan
VEGF.
Slide dilakukan
pengecatan
imunohistokimia
sebagai berikut : 1.
Pemotongan blok parafin dengan tebal 4-5 mikron. Diletakkan pada slide poly-L- lysine selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
C selama 1 malam agar lebih melekat pada slide.
2. Deparafinisasi :
a. Direndam dalam xylol I selama 5 menit
b. Direndam dalam xylol II selama 5 menit
c. Direndam dalam xylol III selama 5 menit
d. Direndam dalam xylol IV selama 5 menit
e. Direndam dalam alkohol absolut selama 5 menit
f. Direndam dalam alkohol 95 selama 5 menit
g. Direndam dalam alkohol 70 selama 5 menit
h. Dicuci dengan aquabides selama 5 menit
3. Retrival antigen dilakukan pada microwave oven dengan buffer sitrat pH 6,4
pada suhu sedang selama 2 menit kemudian dilanjutkan pada suhu rendah selama 1 menit.
4. Cuci dengan PBS selama 2 x 5 menit.
5. Tahap quenching endogenous peroksidase yaitu dengan memasukkan slide-
slide tersebut ke dalam methanol H
2
O
2
0,3 selama 30 menit. 6.
Cuci kembali dengan aquadesPBS selama 2 x 5 menit. 7.
Langkah-langkah selanjutnya dilakukan dengan humidified chamber : perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
a. Diberikan blocking reagent, dibiarkan selama 30 menit dan dicuci dengan
aquadestPBS 2 x 5 menit b.
Ditambahkan antibody primer yang telah dilarutkan sebelumnya dalam antibody diluents 1:50, ditunggu selama 60 menit atau disimpan terlebih
dahulu dalam kulkas pada suhu 40 C selama 18 jam dan dicuci dengan
aquadestPBS 2 x 5 menit. c.
Ditambahkan antibody sekunder berlabel biotin, ditunggu selama 30 menit pada suhu 30
C lalu dicuci dengan aquadestPBS 2 x 5 menit. d.
Ditambahkan subtract DAB diamino benzidine ditunggu selama 5 menit lalu dicuci dengan aquadestPBS 2 x 5 menit.
e. Dilakukan pewarnaan dengan counterstain dengan hematocillin mayer
selama 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir selama 2-5 menit. f.
Ditempelkan deck glass pada mounting media. 8.
Masing-masing sampel diamati dengan mikroskop cahaya dan dievaluasi pada 9 lapang pandang dengan sebaran yang merata kemudian dibuat
reratanya. Tingkat ekspresi
Vascular Endothelial Growth Factor
yang digunakan adalah mouse
–anti VEGF dengan pengenceran 1:100. Sistem deteksi enzimatis ABC
Avidin Biotin Complex
menggunakan enzim peroksidase dan DAB
Diamino Benzidin
sebagai substan enzim. Nilai positif ditunjukkan dengan warna coklat keemasan hingga tua.
commit to user
Penilaian makna tingkat ekpresi
Vascular Endothelial Growth Factor
secara kuantitatif dinyatakan dalam Intensitas I dan Persentase P dan dinyatakan sebagai Skor Histologi.
Skor Histologi dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Tan,
et al.,
2001 Keterangan :
SH : Skor Histologi PS : Persentase Positif Sedang
PK : Persentase Positif Kuat IN : Intensitas Negatif
IK : Intensitas Positif Kuat IS : Intensitas Positif Sedang
IL : Intensitas Positif Lemah PN : Persentase Negatif
Tabel 3.1 Nilai P persentase jumlah sel Kisaran
Grade
0 - 25 1
26 - 50 2
51 – 70
3 76
– 100 4
SH = IKxPK + ISxPS + ILxPL + INxPN perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
Tabel 3.2 Penilaian intensitas warna
Intensitas Grade
Reaksi warna IHC pada Membran Sel
Kuat 3
Coklat tua Sedang
2 Coklat muda
Lemah 1
Kuning keemasan Negatif
Biru-ungu Budiani,
et al.,
2006
Interval nilai skor histologi Makna kualitatif
0,00 – 3,75
: Negatif 3,76
– 7,50 : Positif lemah
7,51 – 11,25
: Positif sedang 11,26
– 15,00 : Positif kuat
Penilaian intensitas dan persentase dilaksanakan secara manual dengan mikroskop. Nilai skor histologi yang diperoleh berasal dari sembilan lapang
pandang untuk masing-masing slide dan diambil nilai reratanya.
K. Teknik Analisa Data