Cara Kerja TESIS Fitri Sholihati S.500109020

Hasil ukur : Nilai positif : warna kecoklatan pada membran sel target. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam skor histologis. Variabel skala numerik.

I. Alat Penelitian

Alat penelitian yang dipakai pada penelitian ini yaitu : 1. Alat pemeriksaan THT yaitu : lampu kepala, spekulum hidung, spatula lidah, pinset bayonet, kapas, lidokain efedrin 2 . 2. Alat dan bahan melakukan biopsi nasofaring : tang biopsi , spekulum hidung, pinset bayonet, kapas, kasa, alat nasoendoskopi, xylocain spray 10, PBS formalin, botol untuk menyimpan jaringan biopsi. 3. Alat untuk pengecatan imunohistokimia : Mikrotom, Poly L-Lysine glass slide SIGMA, termometer, mounting media, microwave oven, inkubator, pipet mikro, deck glass, stop watch, humidified chamber , ruangan dalam kondisi kelembaban tinggi. 4. Mikroskop OLYMPUS seri B X 41.

J. Cara Kerja

Penderita dengan kecurigaan KNF dilakukan biopsi nasofaring dengan bantuan nasoendoskopi. Jaringan yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi PBS formalin. Botol yang berisi jaringan dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Moewardi Surakarta untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan hematosillin eosin oleh dokter spesialis Patologi Anatomi. Preparat dengan hasil bacaan histopatologi KNF WHO tipe 3 Undifferentiated dilakukan pemotongan pada blok parafin setebal 4 mikron. perpustakaan.uns.ac.id commit to user Hasil masing-masing kelompok blok parafin dipotong menjadi slide dan digunakan untuk pemeriksaan VEGF. Slide dilakukan pengecatan imunohistokimia sebagai berikut : 1. Pemotongan blok parafin dengan tebal 4-5 mikron. Diletakkan pada slide poly-L- lysine selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 malam agar lebih melekat pada slide. 2. Deparafinisasi : a. Direndam dalam xylol I selama 5 menit b. Direndam dalam xylol II selama 5 menit c. Direndam dalam xylol III selama 5 menit d. Direndam dalam xylol IV selama 5 menit e. Direndam dalam alkohol absolut selama 5 menit f. Direndam dalam alkohol 95 selama 5 menit g. Direndam dalam alkohol 70 selama 5 menit h. Dicuci dengan aquabides selama 5 menit 3. Retrival antigen dilakukan pada microwave oven dengan buffer sitrat pH 6,4 pada suhu sedang selama 2 menit kemudian dilanjutkan pada suhu rendah selama 1 menit. 4. Cuci dengan PBS selama 2 x 5 menit. 5. Tahap quenching endogenous peroksidase yaitu dengan memasukkan slide- slide tersebut ke dalam methanol H 2 O 2 0,3 selama 30 menit. 6. Cuci kembali dengan aquadesPBS selama 2 x 5 menit. 7. Langkah-langkah selanjutnya dilakukan dengan humidified chamber : perpustakaan.uns.ac.id commit to user a. Diberikan blocking reagent, dibiarkan selama 30 menit dan dicuci dengan aquadestPBS 2 x 5 menit b. Ditambahkan antibody primer yang telah dilarutkan sebelumnya dalam antibody diluents 1:50, ditunggu selama 60 menit atau disimpan terlebih dahulu dalam kulkas pada suhu 40 C selama 18 jam dan dicuci dengan aquadestPBS 2 x 5 menit. c. Ditambahkan antibody sekunder berlabel biotin, ditunggu selama 30 menit pada suhu 30 C lalu dicuci dengan aquadestPBS 2 x 5 menit. d. Ditambahkan subtract DAB diamino benzidine ditunggu selama 5 menit lalu dicuci dengan aquadestPBS 2 x 5 menit. e. Dilakukan pewarnaan dengan counterstain dengan hematocillin mayer selama 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir selama 2-5 menit. f. Ditempelkan deck glass pada mounting media. 8. Masing-masing sampel diamati dengan mikroskop cahaya dan dievaluasi pada 9 lapang pandang dengan sebaran yang merata kemudian dibuat reratanya. Tingkat ekspresi Vascular Endothelial Growth Factor yang digunakan adalah mouse –anti VEGF dengan pengenceran 1:100. Sistem deteksi enzimatis ABC Avidin Biotin Complex menggunakan enzim peroksidase dan DAB Diamino Benzidin sebagai substan enzim. Nilai positif ditunjukkan dengan warna coklat keemasan hingga tua. commit to user Penilaian makna tingkat ekpresi Vascular Endothelial Growth Factor secara kuantitatif dinyatakan dalam Intensitas I dan Persentase P dan dinyatakan sebagai Skor Histologi. Skor Histologi dihitung dengan rumus sebagai berikut : Tan, et al., 2001 Keterangan : SH : Skor Histologi PS : Persentase Positif Sedang PK : Persentase Positif Kuat IN : Intensitas Negatif IK : Intensitas Positif Kuat IS : Intensitas Positif Sedang IL : Intensitas Positif Lemah PN : Persentase Negatif Tabel 3.1 Nilai P persentase jumlah sel Kisaran Grade 0 - 25 1 26 - 50 2 51 – 70 3 76 – 100 4 SH = IKxPK + ISxPS + ILxPL + INxPN perpustakaan.uns.ac.id commit to user Tabel 3.2 Penilaian intensitas warna Intensitas Grade Reaksi warna IHC pada Membran Sel Kuat 3 Coklat tua Sedang 2 Coklat muda Lemah 1 Kuning keemasan Negatif Biru-ungu Budiani, et al., 2006 Interval nilai skor histologi Makna kualitatif 0,00 – 3,75 : Negatif 3,76 – 7,50 : Positif lemah 7,51 – 11,25 : Positif sedang 11,26 – 15,00 : Positif kuat Penilaian intensitas dan persentase dilaksanakan secara manual dengan mikroskop. Nilai skor histologi yang diperoleh berasal dari sembilan lapang pandang untuk masing-masing slide dan diambil nilai reratanya.

K. Teknik Analisa Data