Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil

19

BAB III Metode Penelitian

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan yaitu jenis penelitian eksperimental murni, yaitu penelitian terhadap kelompok perlakuan yang kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak diberikan perlakuan. Penelitian dilakukan dengan rancangan acak lengkap pola searah yaitu menetapkan sampel dengan pengacakan untuk kelompok perlakuan dan tanpa perlakuan. Pengacakan sampel dimaksudkan agar setiap sampel memiliki kesempatan yang sama untuk masuk dalam kelompok perlakuan maupun kelompok tanpa perlakuan. Penelitian lengkap yaitu dalam menggunakan kelompok positif, kelompok negatif, dan kelompok perlakuan. Pola searah artinya adanya perlakuan yang sama untuk kelompok perlakuan yaitu dengan memberikan air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel Utama

a. Variabel Bebas yaitu dosis pemberian air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray. b. Variabel Tergantung yaitu kadar glukosa darah tikus jantan galur wistar.

2. Variabel Pengacau

a. Variabel Pengacau Terkendali 1 Subjek Uji : tikus putih 2 Jenis Kelamin : jantan 3 Galur Spesies subjek uji : galur Wistar 4 Berat Badan subjek uji : 150-200 gram 5 Umur subjek uji : 2-3 bulan 6 Jalur Pemberian : peroral b. Variabel Pengacau Tak Terkendali 1 Kondisi patologis hewan uji

3. Definisi Operasional

a. Air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray merupakan daun insulin segar yang direbus dalam 400 mL air hingga menjadi 200 mL. b. Dosis air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray merupakan sejumlah volume air rebusan daun insulin tiap berat badan hewan uji dengan satuan mlkgBB. c. Uji Toleransi Glukosa Oral UTGO yaitu metode penetapan kadar glukosa darah dengan membebankan glukosa pada tikus mengunakan larutan glukosa secara oral dengan dosis 15 bv;1,75gkgBB. d. LDDK 0-240 kadar glukosa darah yaitu besaran yang menggambarkan jumlah kadar glukosa dalam darah pada rentang waktu menit ke- 0 sampai dengan menit ke -240 menggunakan metode trapezoid. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan Penelitian

a. Hewan uji Tikus putih jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan, berat badan 150- 200 gram diperoleh dari daerah Bantul. b. Bahan uji Daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray diambil dari daerah kelurahan Jagalan, Surakarta. c. Senyawa pembanding Glibenklamid dari PT. Indofarma. d. Pereaksi untuk pengukuran kadar glukosa Enzim Glucose GOD FSDiaysis ® , Germany, dengan komposisi terlihat pada Tabel II. Tabel II. Isi Pereaksi Enzim Glucose GOD-PAP Reagen Phospat buffer pH 7,5 250 mmoll Phenol 5 mmoll 4-aminoantipyrine 0,5 mmoll Glukosa oksidase GOD ≥ 10 kUl Phenol Amino Antipirin Peroksidase PAP ≤ 1 kUl Glukosa standar 100 mgdl 5,5 mmoldl e. Lain-lain 1 Aquadest 2 Aquabidest 3 EDTA sebagai antikoagulan 4 Glukosa monohidrat dosis 15 bv; 1,75gkgBB sebagai larutan untuk uji toleransi glukosa oral 5 CMC 1 sebagai kontrol normal dan pelarut glibenklamid

2. Alat Penelitian

a. Alat gelas Beker glass, pengaduk, gelas ukur, tabung reaksi merk pyrex ® b. Jarum suntik per oral p.o c. Pipa kapiler d. Tabung effendorf e. Tabung reaksi f. Mikropipet g. Sentrifuge h. Vortex i. Microlab-200 j. Stopwatch k. Alat timbang elektrik

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Determinasi dilakukan di Unit II Fakultas Farmasi UGM Yogyakarta, Bagian Biologi Farmasi.

2. Pengumpulan Bahan Uji

Daun Insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray yang digunakan adalah daun segar yang berasal dari tanaman daun insulin dari daerah kelurahan Jagalan, Surakarta.

3. Pembuatan Air Rebusan Daun Insulin

Berdasarkan dari yang digunakan masyarakat pada umumnya yakni sebanyak 7 gram daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray di rebus dalam 400 ml aquadest sampai menjadi 200 ml.

4. Perhitungan Dosis Pemberian Air Rebusan Daun Insulin

Dosis pemakaian air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray untuk manusia dewasa 70 kg adalah 7 gram daun insulin. Konversi dosis manusia 70kg ke tikus 200g yaitu 0,018, sehingga dosis untuk tikus 200 gram sebagai berikut : 0,018 x 7 gram = 0,126 gram200gBB Dosis untuk 1 kg tikus : x 0,126 gram = 0,63 gramkgBB = 630 mgkgBB PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Peringkat dosis tertinggi air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray dihitung dengan menggunakan konsentrasi 40 gram200mL. D x BB = C x V D x 200 gram = 0,2 grammL x 3 mL D = 0,6 gram200gBB D = 3 gramkgBB D = 3000 mgkgBB Dari kedua dosis tersebut kemudian ditentukan faktor pengali untuk peringkat dosis : F = = = 2,18 Peringkat dosis yang diperoleh berdasarkan faktor pengali : Dosis I = 630 mgkgBB Dosis II = 1373 mgkgBB Dosis III = 3000 mgkgBB

5. Preparasi Bahan

a. Pembuatan larutan stok glukosa monohidrat p.a 15,0 bv Glukosa monohidrat p.a ditimbang sebanyak 3,75 gram dilarutkan dalam aquadest panas dalam labu takar 25,0 mL sampai tanda batas. b. Pembuatan larutan CMC 1 bv CMC ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dilarutkan dalam 100 mL aquadest dalam labu takar. c. Penentuan dosis glibenklamid Dosis glibenklamid untuk manusia 70 kgBB yaitu 5 mg, sehingga dosis untuk 200 g tikus yaitu 5 mg glibenklamid x 0,018 = 0,09 mg glibenklamid 200 gBB = 0,45 mg glibenklamid kgBB d. Penetapan Konsentrasi Glibenklamid Volume pemberian glibenklamid ditetapkan sebesar 0,8 mL, sehingga diperoleh konsentrasi sebagai berikut : Dosis x Berat Badan = Konsentrasi C x Volume 0,45 mgkgBB x 0,200 kgBB = C x 0,8 mL C = C = 0,1125 mgmL

6. Orientasi Waktu Pemberian Glibenklamid

Orientasi menggunakan dua belas ekor tikus yang dibagi menjadi 3 kelompok yaitu kelompok menit ke-15 sebelum UTGO, menit ke-30 sebelum UTGO, dan menit ke-45 sebelum UTGO. Masing-masing kelompok mendapat perlakuan kontrol positif dan negatif. Semua pemberian dilakukan dilakukan secara peroral kemudian dilakukan UTGO dengan memberikan larutan glukosa monohidrat dosis 15 bv, 1,75 gkgBB. Pengambilan darah dilakukan sesaat sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar glukosa darah dengan metode GOD-PAP dan dibuat kurva UTGO serta perhitungan harga LDDK 0-240 . Penentuan waktu pemberian glibenklamid berdasarkan pada nilai LDDK 0-240 kontrol positif terkecil.

7. Orientasi Dosis Pemberian Air Rebusan Daun Insulin Tithonia

diversifolia Hemsl. A. Gray Dosis pemakaian air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray untuk manusia dewasa 70 kg adalah 7 gram daun insulin. Konversi dosis manusia 70kg ke tikus 200g yaitu 0,018, sehingga dosis untuk tikus 200 gram sebagai berikut : 0,018 x 7 gram = 0,126 gram200gBB Dosis untuk 1 kg tikus : x 0,126 gram = 0,63 gramkgBB = 630 mgkgBB Dosis diatas digunakan sebagai dosis tertinggi, kemudian dibuat peringkat dosis dengan menurunkan 1,5 kali. Sehingga diperoleh dosis tengah sebesar 420 mgkgBB dan dosis terendah 280 mgkgBB. Berdasarkan hasil orientasi, dosis tersebut tidak menunjukkan hasil penurunan kadar glukosa darah yang berarti sehingga ditetapkan dosis baru untuk digunakan dalam penelitian.

8. Penetapan Waktu Pemberian Air Rebusan Daun Insulin Tithonia

diversifolia Hemsl. A. Gray Waktu pemberian air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray ditetapkan berdasarkan waktu pemberian glibenklamid.

9. Tahap Percobaan

Gambar 4. Skema Penelitian a. Pengelompokan hewan uji Penelitian ini menggunakan 30 ekor tikus dibagi secara acak menjadi 6 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Tiap hewan uji diadaptasikan dalam laboratorium selama 7 hari diberi pakan dan minum ad libitum. Sebelum mendapat perlakuan masing-masing kelompok dipuasakan 10- 16 jam namun diberi minum ad libitum, kemudian setiap kelompok diberi perlakuan sesuai kelompok seperti berikut : 1 Kelompok 1 : Kontrol normal, hewan uji diberi CMC 1 20 mlkgBB tanpa dibebani glukosa 2 Kelompok 2 : Kontrol positif, hewan uji diberi glibenklamid dengan dosis 0,45 mgkgBB dan dibebani glukosa dengan dosis 15 bv;1,75gkgBB 3 Kelompok 3 : Kontrol negatif, hewan uji diberi CMC 1 20 mlkgBB dan dibebani glukosa dengan dosis 15 bv;1,75gkgBB 4 Kelompok 4 : Perlakuan, hewan uji diberikan air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray dosis 630 mgkgBB dan dibebani glukosa dosis 15 bv;1,75gkgBB 5 Kelompok 5 : Perlakuan, hewan uji diberikan air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray dosis 1373 mgkgBB dan dibebani glukosa dosis 15 bv;1,75gkgBB 6 Kelompok 6 : Perlakuan, hewan uji diberikan air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray dosis 3000 mgkgBB dan dibebani glukosa dosis 15 bv;1,75gkgBB Setiap kelompok diberi perlakuan sesuai dengan kelompoknya secara per oral. Lalu setelah beberapa menit berdasarkan hasil orientasi glibenklamid, diambil cuplikan darah sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan dilanjutkan UTGO dengan memberikan larutan glukosa monohidrat dosis 15 bv;1,75gkgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan pada menit ke – 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan metode GOD-PAP, lalu dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK 0-240 .

10. Penetapan kadar glukosa darah dengan metode GOD-PAP

Darah tikus diambil melalui mata tikus vena orbitalis sebanyak 0,5ml ditampung dalam effendorf, lalu disentrifuge 30 menit 3000 rpm. Plasma diambil kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan reagen lalu divortex dan diukur absorbansinya menggunakan microlab-200 dengan λ 500 nm. Kadar glukosa dinyatakan dalam mgdL. Pengukuran kadar glukosa dilakukan di laboratorium Fisiologi-Biokimia Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta. Tabel III. Volume Pengukuran Kadar Glukosa Darah Bahan Sampel ml Standar ml Blanko ml Supernatan 0,01 - - Larutan baku glukosa - 0,01 - Pereaksi GOD-PAP 1,00 1,00 1,00

E. Analisis Hasil

Nilai LDDK 0-240 glukosa darah dari setiap kelompok diuji distribusi menggunakan uji Kolmogrov Smirnov kemudian apabila distribusi termasuk normal maka dilanjutkan dengan analisis One Way ANOVA dan Post Hoc Test Scheffe dengan tingkat kepercayaan 95. Apabila nilai LDDK 0-240 memiliki variansi yang berbeda maka dilakukan uji Kruskal Wallis dan dilanjutkan uji Mann Whitney dengan tingkat kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok apakah bermakna p0,005 atau tidak bermakna p0,005. 31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Sebelum melakukan pengujian efek penurunan kadar glukosa darah dari daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray, dilakukan determinasi tanaman dengan tujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan telah benar dan dapat dipastikan tidak terjadi kesalahan dalam pengambilan bahan tanaman uji. Determinasi dilakukan di Unit II Fakultas Farmasi UGM Yogyakarta Bagian Biologi Farmasi. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang dideterminasi benar tanaman daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray Lampiran 2.

B. Hasil Percobaan Pendahuluan

Percobaan pendahuluan dilakukan untuk menentukan langkah penelitian selanjutnya. Percobaan pendahuluan yang dilakukan antara lain penetapan waktu pemberian glibenklamid dan penetapan dosis sediaan air rebusan daun insulin Tithonia diversifolia Hemsl. A. Gray.

1. Penetapan Waktu Pemberian Glibenklamid

Penetapan waktu pemberian glibenklamid dilakukan agar memperoleh waktu optimum yang dapat menghasilkan presentase penurunan kadar glukosa darah terbesar berdasarkan penurunan harga luas daerah dibawah kurva dari menit PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI